Способы культивирования
Для выращивания бактерий используют следующие способы их культивирования: стационарный, глубинный с аэрацией и с использованием проточных питательных сред.
Стационарный способ: питательные среды сохраняются постоянными, с ними никаких дополнительных манипуляций не производят. Однако при таком способе культивирования в жидких питательных средах, где преобладают анаэробные энергетические процессы, выход биомассы незначителен. Поэтому в связи с развитием микробиологической промышленности были разработаны принципиально новые способы культивирования, позволяющие получать гораздо больший выход биомассы или биологически активных соединений. К их числу относятся метод глубинного культивирования с аэрацией и метод использования проточных сред.
Метод глубинного культивирования с аэрацией. Для выращивания с помощью этого способа применяют специальные устройства – реакторы. Они представляют собой герметические котлы (приспособленные автоклавы), в которые заливается жидкая питательная среда. Реакторы снабжены автоматическими приспособлениями, позволяющими поддерживать постоянную температуру, оптимальные рН иrН, дозированное поступление необходимых дополнительных питательных вещест2в. Однако главная особенность таких реакторов в том, что они постоянно продуваются стерильным воздухом и в них установлены мешалки, с помощью которых среда постоянно перемешивается. Поэтому во всей питательной среде создается такая концентрация свободного кислорода, при которой энергетические процессы происходят в аэробных условиях, т. е. достигается максимальное использование энергии, заключенной в глюкозе, а следовательно, и максимальный выход биомассы. Для примера: выход биомассы при стационарном методе культивирования E. coli в МПБ через 18 – 20 ч составляет 1 – 2 млрд клеток на 1 мл среды, а при глубинном методе через 12 – 14 ч – 50 – 60 млрд клеток/мл среды.
Использование проточных питательных сред позволяет создать условия, при которых клетки имеют возможность длительное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же условиях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Методы получения непрерывных культур основаны на том, что в аппарат, где растут клетки, непрерывно добавляют свежую питательную среду и одновременно из него удаляют соответствующее количество бактерий.
Различают два типа таких аппаратов: хемостаты и турбидостаты. Хемостат – аппарат, в который постоянно из особого резервуара добавляется свежая питательная среда. Благодаря механическому перемешиванию и аэрации среды в ней создаются оптимальные условия для снабжения бактерий кислородом и вновь добавляемыми питательными веществами, по мере поступления которых часть популяции бактерий из аппарата удаляется.
Принцип работы турбидостата основан на поддержании постоянной плотности (мутности) бактериальной популяции в аппарате. Степень мутности контролируется с помощью фотоэлементов, которые через систему реле регулируют поступление питательных веществ в аппарат. Все питательные вещества в ней содержатся в избытке, и скорость роста приближается к максимальной. В таких аппаратах непрерывного культивирования микроорганизмов (АНКМ) все необходимые параметры для роста соответствующего вида микроорганизма задаются и поддерживаются с помощью специальных автоматических приборов. Благодаря сохранению неизменных условий среды непрерывная культура постоянно находится в наиболее желательной фазе роста, при которой обеспечивается максимальный выход биологически важных соединений (антибиотики, витамины, аминокислоты и т. п.) либо биомассы. Таким образом, в соответствии со способами культивирования различают периодические (при стационарном и глубинном методах культивирования) и непрерывные (при проточном способе) культуры микроорганизмов. Кроме того, при определенных условиях получают синхронные культуры, т. е. культуры, в которых все клетки одновременно (синхронно) делятся. Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2 – 3 циклов деления, а затем она нарушается. Синхронные культуры используют в основном для изучения тех или иных стадий клеточного цикла бактерий и роли отдельных генов (и их продуктов) в их осуществлении.
