2.3. Бактерии-симбионты. Роль в физиологии медицинских пиявок
Рассматривая биологию медицинских пиявок, необходимо более подробно остановиться на проблеме, которая обычно достаточно бегло и неполно отражается в литературе. Речь идет о микроорганизмах (микрофлоре), обнаруживаемых в желудковой кишке медицинских пиявок. Позже мы коснемся этого вопроса в клиническом плане, ибо его недооценка, а порой и элементарное незнание могут привести к серьезным осложнениям при проведении лечения. Более того, эта проблема абсолютно игнорируется при обу-чении на различных курсах по гирудотерапии. Видимо, это связано с недостаточной информированностью преподавателей и успокоенностью специалистов благодаря широко декларируемому в отечественной литературе «бактерицидному действию медицинских пиявок».
Дело в том, что желудочно-кишечный тракт медицинских пиявок, как, впрочем, и пиявок других видов, не стерилен. Он заселен микроорганизмами. Причем у Hirudo medicinalis, как правило, определяется один вид бактерий, а не ассоциации микроорганизмов, характерные для других пиявок. Этот вид бактерий давно обратил на себя внимание исследователей. В 1946 году М. Б. Голькиным (здесь и далее приводится по: Хомякова Т. И. и др., 1998) бактерия была выделена и морфологически описана как подвижная, утолщенная посередине палочка размерами 0,6 на 2,5–4,5 мкм, содержащая 2–3 зернистых включения, исчезающих при культивации на питательных средах, и названа «Пиявочная бактерия». H. Busing и соавторы (1953) определили ее как самостоятельный вид, который и назвали «Пиявочная бактерия» – Bacilus hirudinis. Впоследствии оказалось, что на самом деле Bacilus hirudinis является Aeromonas hydrophila. В одной из последних работ, посвященных исследованию микрофлоры медицинских пиявок, J. Graf (1999) с высокой степенью достоверности (в том числе и путем сравнения определенных участков генома) показал, что бактерия-симбионт относится к Aeromonas veronii biovar sobria. Следует, однако, отметить, что автор изучал не диких (природных) пиявок, как в большинстве предыдущих исследований, а выращенных на фермах в Германии (Noyer Apotheke) и Англии (Biopharm), и его выводы требуют некоторых уточнений. Однако и по данным D. R. Mackay и соавторов (1999), в большинстве исследованных ими пиявок обнаруживаются A. sobria.
Что же представляет собой Aeromonas? Далее приводятся данные Т. И. Хомяковой и соавторов (1998), суммированные ими в обзоре, посвященном бактерии-симбионту: «Aeromonas – грамотрицательные палочки, факультативные анаэробы. Встречаются в пресных и сточных водах, некоторые виды патогенны для рыб и лягушек, вызывая у них септицемию. У человека вызывают диарею и бактериемию. С патогенными свойствами A. hydrophila связано много публикаций как в отечественной, так и в зарубежной литературе. Однако следует отметить, что существует множество различных штаммов этой бактерии, значительно отличающихся друг от друга, в том числе и в отношении патогенности для человека. Так, штаммы, выделенные из тканей и жидкостей больных, несколько отличаются от штаммов, выделенных из окружающей среды. Поверхностно-клеточные свойства различных штаммов и их геномный состав также различны. Даже внутри одного штамма возможны различия в структурных и патогенных свойствах».
С самого начала ученых интересовала возможная роль этой бактерии как в жизнедеятельности пиявок, так и при их лечебном применении. Накопленные к настоящему времени факты позволяют считать, что Aeromonas, в обычных условиях обитающая в кишечнике червя, является симбионтом пиявки и полезна для организма хозяина. Этот вывод основан на ряде наблюдений.
Во-первых, еще в 1946 году была показана способность «Пиявочной бактерии» синтезировать вещество, препятствующее свертыванию крови. В пользу предположения о возможной роли бактерии в поддержании крови в желудке пиявки в жидком состоянии говорит тот факт, что при более поздних исследованиях бактерии был обнаружен фермент (металлопротеиназа), переводящий g-цепь димера фибрина в мономерную форму. Он может участвовать в процессах фибринолиза. Исследования в этом направлении продолжаются, однако до настоящего времени степень участия бактерий в процессе поддержания жидкого состояния крови остается не до конца выясненной.
Во-вторых, бактерия играет определенную роль в процессах пищеварения у пиявок. Если анатомическое строение желудочно-кишечного тракта пиявок характеризуется наличием четкой дифференцировки различных отделов (глотка, желудок, кишечник, прямая кишка), то на клеточном (гистологическом) уровне различия в строении выстилки различных отделов кишечной трубки незначительны. Отсутствие клеток, секретирующих пищеварительные ферменты, подтверждалось и результатами биохимических исследований. Явная недостаточность ферментов, которые, как принято считать, необходимы для полноценного переваривания белка, позволила предположить, что «Пиявочная бактерия» участвует в процессах пищеварения. Эта гипотеза получила серьезную поддержку в работе H. Busing и соавторов (1953), показавших, что бактерия, выделенная ими из кишечника медицинской пиявки, in vitro демонстрировала способность медленно переваривать кровь. В 1967 году J. B. Jennings и V. M. van der Lande опубликовали результаты своего исследования различных видов пиявок. Изучение пищеварительных ферментов выявило наличие экзопептидаз при полном отсутствии эндопептидаз, липазы и амилазы. А исследовав выделенную от медицинской пиявки Aeromonas, авторы обнаружили у нее ферменты, способные играть определенную роль в процессах пищеварения хозяина.
В-третьих, высказано предположение (Хомякова Т. И., Хомяков Ю. Н.), что микрофлора может участвовать в обеспечении пиявки некоторыми питательными веществами, необходимыми для ее жизнедеятельности (своеобразные пиявочные витамины).
В-четвертых, анализ имеющихся данных литературы позволяет сделать вывод о важной роли Aeromonas для предупреждения размножения иных видов микроорганизмов, а возможно, и вирусов, попадающих в желудочно-кишечный тракт пиявки с кровью больных животных. Это подтверждается многочисленными наблюдениями, показавшими, что уже в первые часы после питания пиявки в ее желудке происходит значительное увеличение количества бактерий-симбионтов.
Таким образом, хотя роль, степень и характер участия Aeromonas в различных процессах жизнедеятельности медицинской пиявки требуют дальнейшего изучения, приведенные факты, бесспорно, позволяют сделать вывод о ее пользе для организма пиявки.
Между червем и обитающими в его кишечнике бактериями существует сложная система взаимоотношений. Так специфические ингибиторы протеиназ, вырабатываемые железами медицинской пиявки (эглины и бделлины), препятствуют быстрой пролиферации эндосимбионтов (Roters F. J., Zebe E., 1992). По неопубликованным данным Ю. Н. Хомякова, дестабилаза секрета слюнных желез пиявки также обладает бактерицидным в отношении Aeromonas действием. Эти данные подтверждены и в работе Л. Л. Заваловой и соавторов (2001).
Как уже говорилось, в отечественной литературе по гирудотерапии декларируется противомикробное действие пиявок или отдельных компонентов их слюны (Гирудотерапия: Руководство для врачей / Под ред. В. А. Савинова, 2004). Нередко это трактуется как наличие в секрете пиявок веществ, способных уничтожать бактерии, вызывающие патологические процессы в организме человека. Ошибочность этих заявлений связана с механическим переносом выводов из исследований, проведенных in vitro, на организм медицинской пиявки и человека. Фактически же при тех концентрациях ферментов, которые имеются в живой пиявке (а не ее экстракте), а тем более – учитывая количество веществ, вводимых пиявкой в ткани человека, речь должна идти, скорее, о бактериостатическом действии, да и то лишь в тканях непосредственно в зоне ранки.
Многих исследователей интересовало: если пиявка напала на больное животное, существует ли опасность переноса инфекции при применении пиявки в дальнейшем, а также что происходит с микроорганизмами, попадающими в желудковую кишку пиявки вместе с насасываемой ею кровью. Подобные исследования предпринимались неоднократно. В отечественной литературе чаще всего ссылаются на работу П. Н. Андреева (1923). Позволим себе остановиться на ней чуть подробнее. Целью работы было исследование возможности использования пиявки в качестве своеобразного биологического контейнера для ряда патогенных микроорганизмов. В связи с этим определялся период времени, в течение которого различные патогенные бактерии и простейшие сохраняют жизнеспособность и вирулентность внутри тела пиявки в случаях их поглощения с насасываемой кровью. До исследований пиявок кормили на больных животных. Затем через различные сроки изучали жизнеспособность микроорганизмов внутри тела пиявки. Кровь получали выдавливанием или нанесением соли на тело пиявки. Были исследованы бактерии тифа и сибирской язвы (в двух опытах), спирохет кур (в пяти опытах), бактерии паратифа, бактерии септицемии свиней, туберкулеза, Typus humanus, жемчужницы, трипаносом Lewisii, Equiperdum, Brucei, а также вирус оспы кур и чумы свиней (по одному опыту для каждого возбудителя). Бактерии тифа определяли высевом на питательную среду. В одном опыте их удалось выявить до 6 дней, в другом – до 30. Бациллы сибирской язвы обнаруживались посредством культур и прививок животным. Они сохранялись до 14 и 17 дней. Для спирохет кур наибольший срок жизнеспособности оказался 3 недели. Трипаносомы при микроскопическом исследовании определялись автором до 9 дней. Вместе с тем бактерии септицемии свиней оставались жизнеспособны до 22 дней, бациллы Typus bovines – до 60 дней, бактерии паратифа В – до 3 месяцев. Автор сделал выводы, во-первых, о том, что сохраняемость простейших в организме пиявок меньше, чем бактерий. Это объяснялось их меньшей общей устойчивостью к внешним неблагоприятным факторам. Во-вторых – о наличии бактерицидных свойств у содержимого кишечного канала пиявки. Без-условно, малое количество опытов, а главное, недостатки способа получения материала в приведенной работе, не дает возможности сделать окончательных выводов о длительности сохранения различных бактерий и простейших в желудке пиявки. Вместе с тем анализ имеющихся в зарубежной литературе данных позволяет констатировать, что «чужеродные» для пиявки микроорганизмы могут в течение некоторого периода сохраняться и даже до некоторой степени размножаться, не нанося существенного вреда ее «здоровью» (Graf J., 1999).
M. Nehili и соавторы (1994) выполнили серьезное исследование длительности сохранения различных микроорганизмов в кишечнике пиявок, содержащихся при комнатной (+18 °С) и пониженной (+6 °С) температурах. Ими показано, что эритроциты и лейкоциты не разрушаются в желудковой кишке до 5–6 недель, а при содержании животных в низкой температуре – до нескольких месяцев, в том числе и будучи инвазированы. Такие паразитирующие простейшие, как Toxoplasma gondii, Trypanosoma brucei, оказались даже способны размножаться в желудковой кишке искусственно инвазированных пиявок, а в случае Plasmodium berghei это продолжалось до тех пор, пока все эритроциты не были поражены. Внутриклеточные паразиты оставались жизнеспособными до тех пор, пока эритроциты или лимфоциты сохраняли форму. Однако, по данным электронной микроскопии, они не проникали в слюнные железы, без чего невозможно заражение.
Исследуя количественную динамику размножения Esche-richia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aurens в желудковой кишке после их добавления в кровь, которой питались пиявки, S. Indergand и J. Graf (2000) показали, что у двух из трех (в первом опыте) и у двух из четырех (во втором опыте) исследованных ими животных Е. coli обнаруживалась через 42 и 162 часа соответственно. В отличие от Е. coli, P. aeruginosa и St. aurens оказались способны сохраняться и даже размножаться в просвете желудковой кишки по крайней мере в течение 162 часов, однако рост их числа был в 100 раз меньше, чем в аналогичных условиях вне организма пиявки. Кроме того, в экспериментах in vitro показано, что, в отличие от результатов ранее проводившихся исследований, Aeromonas, выделенная из желудковой кишки медицинских пиявок, сама по себе не оказывала угнетающего действия ни на одну из исследуемых бактерий. Было высказано предположение, что in vivo, видимо, происходит активация определенных генов симбионта в результате контакта с какими-то клетками внутри пиявки. При этом в случаях, когда пиявки заглатывают микроорганизмы с кровью больных животных, они хотя и персистируют, но не могут размножаться в полной мере, а также вытеснить бактерию-симбионт. В конечном итоге по истечении определенного периода времени чужеродные бактерии погибают, и в кишечнике остается только бактерия-симбионт. Следует отметить, что для исследования брались здоровые полноценные пиявки, приобретенные от фирм-производителей в Англии и Германии, а не дикие, среди которых встречается достаточное количество больных и ослабленных животных.
В западной литературе за последние 10 лет опубликованы результаты ряда научных исследований о паразитах крови, поражающих рыб, земноводных и лягушек, являющихся, наряду с теплокровными животными, источником пищи для дикой медицинской пиявки. Помимо трипаносомы, различными авторами у пиявок обнаруживались Thrombocyto-zoons, Rickettsia, Cercaria, Lankesterella, Babesiasoma, а также микрофилярии и эритроцитарный вирус лягушек. Вместе с насасываемой кровью все вышеназванные организмы могут попадать в кишечник пиявок. Однако эти микроорганизмы не патогенны для человека. Кроме того, как уже указывалось, одного лишь попадания патогенного начала и даже его сохранения в течение некоторого времени еще недостаточно для передачи другому животному или человеку. Еще раз подчеркнем: наличие Aeromonas в кишечном содержимом пиявок отражает их нормальное состояние и обеспечивает у здоровых животных подавление чужеродной флоры.
Таким образом, анализ всех имеющихся в настоящее время литературных данных, собственные наблюдения и исследования процесса размножения и развития пиявок, а также результатов их клинического применения, позволяют нам сделать следующие важные выводы.
• Пиявка в силу особенностей получения пищи приспособлена перерабатывать кровь больных животных.
• Некоторый период времени после питания в ее желудковой кишке могут находиться различные бактерии или простейшие, попавшие туда с кровью больных животных. В этот же период концентрация бактерий-симбионтов максимальна. Они-то и защищают организм пиявки от возможного неблагоприятного действия чужеродных микроорганизмов. В случае же клинического применения такие неотголодавшие пиявки могут стать источником заражения человека.
• В процессе голодания пиявок чужеродные бактерии гибнут или выводятся из ее организма, а титр Aeromonas значительно снижается. Это-то и делает готовую к применению искусственно выращенную пиявку безопасной.
Таким образом, наличие длительного (не менее 3–4 месяцев) периода голодания животного является важнейшим условием безопасного применения пиявок. Кроме того, чрезвычайно важными являются создание для животного в этот период всех условий, необходимых для его нормальной жизнедеятельности, отбор и уничтожение ослабленных особей.
Нам кажутся более чем странными рекомендации некоторых авторов, знакомых только с литературой и абсолютно не владеющих вопросами разведения пиявок, «усиливать антимикробные свойства кишечного канала пиявок путем содержания в воде, лишенной патогенных микроорганизмов», или проводить «строгий микробиологический контроль крови для кормления пиявок», а также «тестировать присутствие крови в кишечном канале пиявок». Еще более лишены оснований рекомендации «выдерживать пиявок в растворе антибиотиков» (Баскова И. П., Исаханян Г. С., 2004). Нет ни одной работы, доказывающей, что выведенная в условиях биофабрики, отголодавшая здоровая пиявка стала бы источником какого-либо иного заражения, чем A. hydrophila. Но и оно зафиксировано в единичных случаях постановки пиявок на трансплантаты, то есть в условиях, при которых отмечается тяжелейшая гипоксия тканей и резко угнетен местный иммунитет. В нашей практике за более чем 20 лет лечения (за это время пролечено нескольких десятков тысяч пациентов) при условии использования здоровых животных, правильном выборе мест приставок и ведении приставочной реакции (о чем далее будет идти речь) образования абсцессов в местах приставки пиявок не отмечалось ни разу. Рекомендации, подобные вышеприведенным, в случае попыток их внедрения могут привести к серьезному кризису в гирудотерапии.
