История первая: Разгаданная тайна, или Висна
Среди заболеваний овец на острове Исландия Б. Сигурдсон столкнулся с одним, история изучения которого оказалась столь же поучительной, сколь и плодотворной.
С 1935 по 1951 год на многих фермах в южных и юго-западных районах острова Исландии начали регистрироваться отдельные случаи неизвестного ранее заболевания с явлениями паралича. Болезнь характеризовалась размытым началом, медленно развивающимися симптомами, она как бы подкрадывалась к животному. Иногда ранними симптомами служили легкое дрожание губ и небольшой наклон головы в сторону. Постепенно симптомы заболевания нарастали – развивались параличи, особенно задних конечностей. Животные уже не могли подниматься. Овцы постепенно теряли в весе, иногда имела место задержка роста. Исход болезни – всегда смертельный. Болезнь была названа висна, что означает «чахнущий»; в названии нашло отражение развитие характерных симптомов у парализованных животных.
Позднее в этих же районах острова стали появляться случаи хронической прогрессирующей пневмонии у овец, получившей название мэди, что означает «одышка». Основным ее симптомом являлась одышка, первоначально проявляющаяся при нагрузке, а позднее – и в состоянии покоя. Так же, как и висна, мэди всегда заканчивается гибелью животных.
Мэди была впервые описана в 1939 году в отдаленном районе Исландии, где в это время еще не было случаев висны или каких-либо других заболеваний среди овец. Поэтому довольно долго висну и мэди рассматривали как два совершенно самостоятельных заболевания. Однако при более пристальном изучении больных животных в стадах все чаще удавалось наблюдать как бы смешанные случаи заболеваний, характеризующиеся клиническими признаками и висны, и мэди. При вскрытии у погибших овец обнаруживали и поражения центральной нервной системы (разрушение белого вещества головного мозга и большие скопления клеток в мозговых оболочках), и поражения в легких и в селезенке (выражающиеся в картине хронического воспаления и разрастания опорной ткани).
Инфекционная природа висны легко доказывалась при заражении здоровых овец суспензиями мозговой ткани больных животных. При этом симптомы развивающегося заболевания полностью совпадали с таковыми при естественно возникшем заболевании. Поэтому с помощью искусственного заражения можно было точно установить, в частности, и продолжительность инкубационного периода при висне, который, как оказалось, может колебаться от б месяцев до б лет (!).
Разделение двух болезней продолжалось до тех пор, пока в 1957–1958 годах Б. Сигурдсон и два его сотрудника, X. Тормар и П. Полсон, не взялись всерьез за поиски возбудителя висны. Успех пришел, когда исследователи начали приготавливать клеточные культуры из мозговой ткани пяти зараженных висной овец (вспомним историю открытия аденовирусов!). О выделении вируса висны ученые сообщили в 1960 году. Ими же были обнаружены некоторые его очень важные свойства.
Так, оказалось, что типичная клиническая картина висны развивается не только после внутримозгового введения вируса здоровым овцам, но и после внутрилегочного их заражения. Более того, вскоре удалось выяснить, что как внутримозговое, так и внутрилегочное заражение вирусом висны овец приводят к развитию поражений и в центральной нервной системе, и в легких в виде прогрессирующей пневмонии. Таким образом, с середины 60-х годов прошлого века было твердо установлено, что висна и мэди представляют собой лишь две формы одной и той же медленной вирусной инфекции овец, проявляющейся либо более выраженными симптомами поражения центральной нервной системы, либо более явными признаками хронической прогрессирующей пневмонии.
Изучение висны сыграло особую роль не только в истории исследования медленных вирусных инфекций, но и в истории развития науки о вирусах вообще. И чем глубже ученые проникали в тайны этой болезни, чем ближе знакомились с ее возбудителем, тем большее чувство недоумения вызывали у них добытые факты.
Вот один из примеров. Исландские вирусологи Б. Сигурдсон, X. Тормар и П. Полсон, те самые, кто впервые открыли вирус висны, решили посмотреть, как поведет себя вирус при заражении им различных клеточных культур. И что же?
Оказалось, что вирус висны в ряде культур вызывает быстро развивающуюся клеточную дегенерацию – цитопатический эффект, о котором уже неоднократно говорилось выше. Казалось бы, этот частный факт не должен был вызвать столь глубокое изумление. Однако, как будет ясно далее, изумляться было чему!
Дело в том, что уже много десятилетий хорошо известна способность подавляющего большинства вирусов вызывать в культурах клеток цитопатический эффект. Результат такого эффекта отлично виден даже при малом увеличении микроскопа и не только служит уже в течение длительного времени надежным показателем вирусной активности, но и свидетельствует о количестве активных вирусных частиц в единице объема испытуемого вируссодержащего материала. И если в каком-либо материале, например в смыве из глотки, хотят определить концентрацию вирусных частиц, то обычно поступают следующим образом.
Готовят 10-кратные разведения испытуемого материала в питательной среде (1:10, 1:100, 1:1000 и т. д.). По 0,1 кубического сантиметра каждого разведения вносят в отдельные лунки планшета с клеточной культурой. Спустя несколько дней в ряде лунок развивается процесс клеточной дегенерации, завершающийся распадом клеточного слоя. После этого можно рассуждать следующим образом. Если, например, наивысшее разведение нашего материала – 1:100 – еще вызывает клеточную дегенерацию, а начиная с разведения 1:1000 и далее никаких признаков гибели клеток не обнаруживается, то мы вправе считать, что в 0,1 кубического сантиметра исходного, например, смыва из глотки содержится по крайней мере не менее 100 вирусных частиц, способных заражать клетки, размножаться в них и вызывать затем их гибель. В подобном случае говорят, что титр вируса (его концентрация в единице объема, обычно в одном кубическом сантиметре) равен 103.
Именно на цитопатическом действии вирусов основаны исследования в вирусологических лабораториях, направленные на обнаружение присутствия вирусов в различных испытуемых материалах и последующее определение их количества в таких материалах.
Обнаружение цитопатического действия вируса висны, которое развивалось иногда даже через 24–48 часов после заражения клеток, как уже было отмечено, явно озадачило исследователей. Было непонятно, каким же образом вирус, вызывающий в организме зараженной овцы «медленный» патологический процесс, растягивающийся на годы, в пробирках с клеточной культурой быстро размножается и разрушает клетки всего слоя. Иными словами, удивление вызывала способность возбудителя типичной медленной инфекции вызывать острую («быструю») форму инфекционного процесса в клетках.
Описанное открытие имело принципиально важное значение; оно находилось в явном противоречии с прежним представлением об исключительности возбудителей медленных вирусных инфекций, которых долгое время даже называли «медленными вирусами». Но с фактами нельзя не считаться! И следовало допустить, что в природе нет «быстрых» и «медленных» вирусов, а есть способность (свойство) вирусов в неодинаковых условиях вызывать различные формы инфекционного процесса.
Совсем недавно был поставлен следующий опыт. Вирусом висны заразили 21 овцу в возрасте от 5 до б месяцев. Через различные промежутки времени у 17 животных развилась характерная клиническая картина со всеми признаками висны. Однако у 4 оставшихся не проявлялось ни малейших признаков заболевания, и все они выглядели совершенно здоровыми, а между тем… из организма таких животных легко выделялся инфекционный вирус висны.
Эта находка сорвала еще одну маску с вируса – возбудителя медленной инфекции: как и подавляющее большинство обычных вирусов, вирус висны оказался способным вызывать кроме медленной еще одну форму инфекционного процесса – латентную инфекцию, отличающуюся, как мы помним, столь глубоко скрытым течением, что организм выглядит совершенно здоровым.
При изучении чувствительности к вирусу висны различных клеточных культур, конечно же, испытали и клетки, полученные из тканей человека. И, представьте, в некоторых из них вирус висны хорошо размножался. Такой результат опытов определил вопрос: не может ли вирус висны быть опасным для человека? Этот вопрос никак нельзя назвать праздным, учитывая, что висна у овец описана в странах Европы, Африки, Северной и Южной Америки. Существование латентной формы висны вызвало среди ученых особое беспокойство за людей, которые по роду своей деятельности могут тесно контактировать с больными животными. И такие контакты имели место, в частности, на многих исландских животноводческих фермах, где за больными овцами ухаживали и взрослые, и дети. При забое больных животных нередко не принимали никаких мер предосторожности. Более того, известно, что в подобных случаях мясо зараженных животных считали вполне пригодным в пищу, и оно поступало в продажу.
Специально проведенные проверочные исследования показали, что висна, к счастью, не распространяется среди людей. Однако «сюрпризы» вируса висны на этом не закончились. Тщательное обследование зараженных овец помогло установить, что в организме таких животных через 2–3 месяца одновременно с накоплением вируса начинают накапливаться и противовирусные антитела. И то, что такие антитела действительно являются противовирусными, легко доказывается в опытах заражения клеточных культур.
Вирус висны предварительно смешивают с сывороткой или спинномозговой жидкостью зараженных овец и такую смесь вводят в культуру клеток. На протяжении многих дней клетки выглядят здоровыми и в них не наблюдается размножения вируса. Если же такую культуру заражают смесью вируса и сыворотки крови от незараженной овцы, то через несколько дней в культуре начинается размножение вируса – и клетки погибают. Отсюда вывод: в организме овцы, зараженной вирусом висны, образуются и постепенно накапливаются противовирусные антитела, которые, однако, не спасают зараженное животное от развития заболевания и последующей гибели.
Результаты этих исследований, конечно же, вызвали огромный интерес у ученых. Вместе с тем они ставили новый непростой вопрос: каким образом в организме животного в условиях постоянного присутствия противовирусных антител может жить и беспрепятственно размножаться вирус висны?
Чтобы ответить на этот вопрос, для эксперимента взяли одну-единственную овцу, которую изучали на протяжении 5 лет после заражения вирусом висны. Из ее организма регулярно выделяли персистирующий вирус и одновременно брали пробы крови для получения сыворотки.
И что же оказалось? А вот что: чем позднее у овцы выделяли из крови вирус висны, тем хуже он нейтрализовывался сывороткой, полученной от этого же животного в самом начале (!) заболевания, т. е. в процессе длительного пребывания в организме животного вирус постепенно менял свойства своих поверхностных структур (антигенов), как бы «уходил» от губительного действия антител, которые, как мы помним, способны соединяться и нейтрализовать активность только точно таких вирусных частиц, в ответ на которые данные антитела вырабатывались.
Работа с особо опасными инфекциями
Обнаруженная изменчивость поверхностных антигенов вируса висны, персистирующего в организме зараженных овец, открыла новый механизм вирусной персистенции, получивший название антигенный дрейф.
Группа американских исследователей из университета Джона Гопкинса попыталась выяснить причины антигенного дрейфа. Для этого от разных овец, поддерживавших скрытую форму инфекции, выделили несколько изолятов вируса. Из этих изолятов и из исходного штамма, который использовали для первоначального заражения всех животных, выделили РНК. Эти-то РНК и подвергли изучению на предмет возможных изменений в их структуре. И такие изменения были выявлены. Интересно, что все изменения регистрировались только в одной зоне вирусных РНК и носили характер точечных мутаций – изменений последовательности структур, составляющих РНК. Более того, ученые показали, что обнаруженные ими нарушения обычной последовательности, характерной для исходного вируса, соответствовали в каждом вирусном изоляте особенностям его антигенного дрейфа. Однако, несмотря на всю оригинальность, этот механизм оказался не единственным, с помощью которого вирус висны длительное время сохраняется в организме зараженных животных.
Оказалось, что излюбленным местом пребывания персистирующего вируса в организме хозяина являются макрофаги – особый вид лейкоцитов, находящихся в крови, селезенке и лимфатических узлах. Вирус висны, попав в макрофаг, не подвергается разрушительному действию его ферментов, т. е. не переваривается, а, напротив, размножается внутри макрофага, становясь неуязвимым даже для действия противовирусных антител.
Дальнейшие исследования позволили обнаружить весьма своеобразную особенность таких зараженных вирусом висны макрофагов, которые, как первоначально казалось, напоминают нечто похожее на «скворечник», дающий приют персистирующему вирусу. Оказалось, что вирус висны способен заражать и некоторые другие клетки соединительной ткани, но в них латентная инфекция формируется благодаря интеграции вирусного генома с клеточным геномом. Такие латентно инфицированные клетки не выделяют инфекционного вируса. Но вот что выяснилось: стоит только к таким скрыто инфицированным клеткам прикрепиться зараженным макрофагам, как в скрыто инфицированных клетках происходит активация вирусной репродукции (вспомните герпетические высыпания!). В результате ранее «безобидные», хотя и зараженные клетки соединительной ткани начинают продуцировать и выделяют в кровь инфекционный вирус висны.
И последнее. Помните, выделение вируса висны и первое знакомство с ним с помощью электронного микроскопа озадачили исследователей – уж очень он был обычен (а ведь болезнь-то не обычная, а «медленная») и очень похож на хорошо известные РНК-содержащие вирусы, вызывающие опухоли у животных. А дело в том, что вирусные частицы висны содержат в своем составе фермент обратную транскриптазу, благодаря работе которого генетический материал вируса встраивается в клеточную хромосому (ДНК). Естественно, что к вирусу висны живейший интерес проявили вирусологи, занимающиеся опухолевыми вирусами. Конечно, сразу же начались поиски опухолеродной способности и у вируса висны.
Многочисленные попытки выявить онкогенные потенции у вируса висны принесли наконец успех двум вирусологам из Национального ракового института (США), Такемото и Стоуну, которые получили злокачественное перерождение – трансформацию – мышиных клеток. Очаги трансформации появились спустя 3 недели после заражения таких клеток вирусом висны. Но при этом инфекционный вирус не удавалось обнаруживать ни в самих трансформированных клетках, ни в окружающей их питательной среде. Положение казалось безвыходным – ученые не могли даже выявить в измененных клетках каких-либо вирусных структур, например антигена.
Такие «безмолвствующие» клетки уже трижды пересевали с одного матраса на другой, но… стоило смешать их с культурой клеток овец, как сразу же обнаруживался инфекционный вирус висны. А если трансформированные вирусом висны такие якобы «безвирусные» мышиные клетки вводили в организм мышат, предварительно облученных рентгеновскими лучами, то у них вскоре развивались большие опухоли, представлявшие собой типичные фибросаркомы, которые потом можно было сколь угодно раз перевивать от одного животного другому.
И вот здесь мы сталкиваемся с еще одним парадоксом возбудителей медленных вирусных инфекций: вирус висны имеет очень много общих черт с опухолевыми вирусами; он содержит в своем составе специальный «инструмент» – фермент обратную транскриптазу; он способен, как показали исследования, вызывать развитие опухоли в искусственных условиях.
А в естественных? В естественных условиях у зараженных вирусом висны овец никогда не обнаруживалось опухолевого роста.
Иными словами, несмотря на полную, если так можно выразиться, онкогенную готовность, вирус ведет себя не как опухолевый, а как инфекционный вирус. На этом основании предположили, что вирус висны представляет собой некий эволюционный мостик между инфекционными и онкогенными РНК-содержащими вирусами: в условиях естественной инфекции он вызывает медленное развитие патологических изменений, которые не сопровождаются опухолевым ростом и не приводят к нему, однако вирус висны обладает явным онкогенным потенциалом, который он может реализовать в определенных специфических условиях. В каких именно, покажут результаты дальнейших исследований.
