Обратная транскриптаза – персональная ретроспектива
Один журналист спросил Хоуарда Темина по случаю вручения ему Нобелевской премии в Стокгольме в 1975 г., за что тот получил эту премию. «Я не могу этого объяснить, вы потеряете нить рассуждений через 30 секунд, – ответил он. – А почему бы вам вместо этого не написать “Бросайте курить?” Это гораздо важнее!» Он был активистом движения против курения и даже говорил об этом в своей благодарственной речи в присутствии короля Швеции, но, как это ни печально, он умер от рака легких, хотя никогда не курил.
Темин даже не пытался объяснить непрофессионалам свое изобретение. А я все же попробую. Я была свидетелем того, как все происходило. Он открыл обратную транскриптазу (ОТ) – фермент, необходимый для репликации ретровирусов, в частности ВИЧ. Этот фермент играет гораздо более важную роль, чем просто фермент для репликации вируса, и, как прогнозировал Темин, он играет важную роль в композиции нашего генома. Эти родственники ретровирусов амплифицируют наши гены, изменяют набор генов наших геномов, но никогда не покидают клетку. В настоящее время даже существует гипотеза, согласно которой РНК в процессе эволюции превратилась в ДНК именно благодаря обратной транскриптазе. Когда я начала исследования обратной транскриптазы, о ней еще ничего не знали, а сейчас, 45 лет спустя, ее рассматривают в качестве одного из наиболее распространенных и, вероятно, самых важных белков, известных в биологии.
Как я стала свидетелем открытия транскриптазы? Тема моих докторской и кандидатской диссертаций – «Репликация вирусов». Хорошо помню некоторые детали. В конце 1960-х я приехала из Беркли (США), где, собрав все свое мужество, оставила физику и резко переключилась на относительно неизвестную для себя область знаний – молекулярную биологию. Это случилось в то время, когда кампус был охвачен студенческими волнениями. Вернувшись в Германию, я искала проект для защиты кандидатской диссертации.
Гюнтер Стент, знаменитый генетик, переехавший из Берлина, пригласил меня к себе в офис в Беркли – у него на столе стоял макет здания Общества Макса Планка в Тюбингене, и он предложил мне поехать туда поработать. Именно так я и поступила: за день рассмотрела три темы и решила выбрать ту, которая показалась мне наиболее интересной и которая, вероятнее всего, могла быстро дать результаты. Восхитительный вид на горную цепь Швабская Юра оказал на мое решение большое влияние ненаучного свойства. Я привнесла в вирусологический институт молекулярную биологию. Однако сначала мне пришлось преодолеть трудный барьер. Мне нужно было научиться изолировать вирус из живых цыплят, которых я заразила вирусом миелобластоза птиц (ВМП), индуцирующим одно из заболеваний крови. Эта процедура предусматривала забор образцов крови непосредственно из сердца цыпленка при помощи гиподермичной иглы – сегодня такой метод не разрешили бы. Предметом изучения моего проекта был механизм репликации этого вируса. Однако несколько месяцев движения вперед в проекте не наблюдалось.
Затем на одной из знаменитых лекций, которые проходят по понедельникам в Обществе Макса Планка в Тюбингене, я узнала от Фридриха Бонхеффера (он только что вернулся с международной Гордоновской конференции), что Хоуард Темин открыл обратную транскриптазу. Некоторые посмеивались и говорили: «Он все еще твердит об этом». Мой проект застопорился, и я решила протестировать обратную транскриптазу. На следующее утро в 8:00 я стояла у двери кабинета Хайнца Шаллера, специалиста по репликации ДНК, так как хотела взять у него «строительные блоки» для ДНК (включая блоки с радиоактивными метками), а не для РНК. Их использование было единственным – но очень важным – отличием данного проекта от моих предыдущих исследований. Я располагала большим количеством вирусов, полученных от цыплят путем проведения пункции сердца. Вечером мы с Шаллером и другими коллегами собрались в помещении, где находился детектор радиоактивности, чтобы проанализировать полученные результаты: было получено невероятное количество ДНК с радиоактивными метками, и показания счетчика зашкаливали. Если иметь нужную идею, можно за один вечер провести эксперимент, достойный Нобелевской премии. Но, к сожалению, у меня не было нужной идеи! Я искала не тот фермент – РНК-полимеразу вместо ДНК-полимеразы. Через несколько недель все блоки для построения ДНК (нуклеотиды) были проданы в разные страны мира. Неионный детергент, используемый для разрушения вируса, доставали на автозаправочных станциях – эта информация разлетелась по миру благодаря сарафанному радио, и в скором времени детергент уже было не достать. Похоже, весь мир занялся исследованием обратной транскриптазы!
Самому же Темину пришлось пережить скептицизм коллег, по мнению которых, идея о том, что ДНК является промежуточным звеном для РНК вируса, была невероятной. Но, основываясь на этих экспериментах, Темин пошел еще дальше и предположил, что промежуточная ДНК, которую он определил как ДНК провируса, интегрируется в ДНК клетки-хозяина. ДНК вируса может замаскироваться в виде ДНК провируса в ДНК клетки-хозяина, что помогает ей выжить. Так появились понятия «ретровирус» и «обратная транскриптаза». Эти эндогенные вирусы и связанные с ними структуры способствуют активному размножению нашего генома, и на 50% благодаря ОТ. Но обратная транскриптаза способна на гораздо большее, и вы в этом убедитесь.
Как получить ДНК из РНК? Нужно сделать больше одного шага? Да, и использовать молекулярные «ножницы», нуклеазу, фермент, называемый рибонуклеазой Н или сокращенно РНКазой Н ().
Во время ланча в Обществе Макса Планка в Тюбингене мне рассказали о студенте Вернере Бюсене, который изучал тимус телят. Обычно он ходил на скотобойню, собирал тимусную ткань и выделял из нее РНКазу. Но не имел представления о том, для чего предназначен этот фермент, – собственно, этого никто не знал. Только через несколько месяцев мне в голову пришла идея, что такой фермент с эффектом «ножниц» может использовать вирус, чтобы избавиться от РНК. Я проверила эту идею. Мой коллега дал мне несколько драгоценных РНК с радиоактивными метками, и я с большой долей уверенности могла доказать наличие активности РНКазы Н после растворения РНК. () Открытие такого расщепляющего фермента (РНКазы Н) в ретровирусе позволило мне напечатать статью в журнале , получить кандидатскую степень, приглашения выступать с лекциями в США и обзавестись на удивление большим количеством соавторов. Все они утверждали, что внесли свой вклад в разработку концепции и подготовку статьи. Как я узнала позднее, стоящие идеи приходят в голову сразу многим ученым. И еще я испытала разочарование, поскольку начиная с этого времени мне практически никогда не удавалось попадать в растущий поток публикаций по этой теме. Меня всегда кто-то опережал.
Существует еще один аспект. Меня часто спрашивают: откуда ученые берут идеи и как делаются открытия? Приведу один пример: сходите с другими учеными, задавайте вопросы, слушайте и учитесь! Только не ходите в фастфуд!
Очень известному позднее вирусологу Питеру Дюсбергу, который был замечательным ученым и преподавателем в Беркли в годы моего пребывания там (а известен он был не только тем, что приклеивал на инкубатор для выращивания культур тканей довольно пикантные фотографии красоток), не удавалось обнаружить в мышиных вирусах фермент РНКаза Н, удаляющий РНКазу. А я изучала куриный вирус. Дюсберг утверждал, что этой РНКазы Н в мышиных вирусах нет. Поэтому, с его точки зрения, мои наблюдения представляли собой единичное исключение, характерное для птичьего вируса. К счастью для меня, он опубликовал свою точку зрения. Это было самое лучшее, что для меня, молодого ученого, могло произойти, поскольку это позволило мне доказать неправоту ученого с мировым именем. Мы с ним дружили всю жизнь. Он часто заходил ко мне, когда приезжал в Берлин к матери; мы даже устраивали крупномасштабные подиумные дискуссии об опасности самого важного ретровируса – ВИЧ и практически никогда не сходились во мнениях.
Мне очень повезло: у меня был значительный объем мышиного вируса. Отчасти это произошло благодаря клеткам «Эвелин» – устойчивой клеточной линии, названной так в честь создавшего ее оператора. Она содержит достаточно много вируса для решения довольно неоднозначных научных вопросов и проведения экспериментов, результатов которых хватит на написание нескольких статей. Однако Эвелин дорого заплатила за это – вследствие пипетирования у нее возникли проблемы с суставами.
Позже, уже работая в Институте Роберта Коха в Берлине, я обратила внимание, что очищенная обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц, а не из одной, как ожидалось. Можно было наблюдать две полосы в эксперименте (). На симпозиуме, который проводился на базе лаборатории в Колд-Спринг-Харбор, несколько докладчиков – известных ученых охарактеризовали вторую полосу как кофактор клеточного происхождения. Было известно, что у прочих полимераз есть кофактор – сигма-фактор. Однако эти выводы носили, скорее, предположительный характер и были основаны на аналогии, а не на экспериментах. Собравшись с духом, я подошла к Джиму Уотсону, который в то время руководил этой лабораторией, и сказала, что наблюдала увеличение нижней полосы за счет верхней. Нижняя полоса характеризует продукт деструкции – это не фактор клетки-хозяина. Если добавить немного протеазы (которая стимулирует процесс разрушения), процесс ускоряется. «У вас есть слайды? Завтра выступите по этой теме». Что я и сделала. Через три месяца он позвонил мне в Институт Коха в Берлине. До сих пор удивляюсь, где он взял мой номер телефона. «Скажите, разве не вы рассказывали о расщеплении обратной транскриптазы и ее разбивке на две субъединицы? А сейчас совершенно неожиданно в сборник симпозиума для публикации представлено четыре материала на эту тему». Никто даже не вспомнил об инородном сигма-факторе клеточного происхождения! И ни слова о полученных мной результатах! В 1975 г. все это было опубликовано в сборнике материалов симпозиума, и моя статья тоже, но, конечно, и другие, «скорректированные». С тех пор он никогда обо мне не забывает. «Привет, Карин», – говорит он в свои 85 с лишним лет и приглашает на лобстера. Уотсон написал книгу «Избегайте занудства»[8], в которой раскрывает секрет своего успеха: «Не нужно быть самым умным среди собеседников, собравшихся за столом». Нужно садиться рядом с теми, кто умнее вас, – именно так я поступила, и это было абсолютно правильно.
Будучи физиком по образованию и аспиранткой, я не умела выделять фермент ОТ. Я снимала комнату в St. Joseph’s Home в Цюрихе (там на прикроватной тумбочке лежала Библия). Мне разрешили наблюдать, как в Институте Чарльза Вайссмана при Цюрихском университете выделяют фермент. Я сидела в холодном помещении – при более высокой температуре фермент теряет активность – и, дрожа всем телом, наблюдала, как оператор проводил изоляцию. Вайссман изолировал Q-бета репликазу из бактерий (об этом пойдет речь в последней главе). После этого я вернулась домой, в Общество Макса Планка в Тюбинге, чтобы выделить из птичьего вируса фермент ОТ, реплицирующий вирус. Мне нужно было научиться у Вайссмана рассчитывать объем материала на входе и выходе, иметь представление о количественных показателях и проверять их баланс. И, какими бы исследованиями после этого мне ни приходилось заниматься, я никогда не забывала количественно определять свои действия. Вместе с Институтом Вайссмана мы разработали несколько моделей репликации вируса при помощи ОТ и РНКазы Н и сделали несколько совместных публикаций. Но процесс репликации ретровируса оказался гораздо сложнее, чем мы предполагали, то есть таким, каким его методом проб и ошибок создала природа. Через несколько лет ко мне обратилась Boehringer Company и заказала большой объем фермента ОТ для продажи: все лаборатории хотели использовать его для получения ДНК из РНК. Проблема, касавшаяся двух субъединиц, оказалась очень значимой, но ее удалось автоматически решить в процессе хранения фермента, как это произошло в моей морозильной камере. Я была рада, что мне удалось компенсировать институту в Берлине затраты на проведение исследования.
Примерно через 15 лет, в начале 1980-х гг., был открыт ВИЧ, самый значимый ретровирус, и мы начали анализировать репликативные ферменты ОТ/РНКазу Н ВИЧ. В настоящее время я пытаюсь «убить» ВИЧ путем (а не ингибирования) «ножниц» РНКазы Н в вирусных частицах вне клетки и надеюсь, что, может быть, это в итоге приведет к разработке терапии и предотвращению продуцирования вируса и распространения заболевания. Когда мы начали работать с ВИЧ, то собирались приготовить моноклональные антитела, разработанные незадолго до этого и подходившие для очистки и определения свойств различных веществ в силу их высокой специфичности. Для первого этапа требовалась иммунизация мышей очищенной ОТ. Маловыраженные признаки «ОТ-ВИЧ» на клетке для мышей вызвали панику в берлинском Обществе Макса Планка. Инспектор, прилетевший из Мюнхена, чтобы разобраться в этом вопросе, не решился пожать мне руку – так боялся вируса. Скандал усилился после чистки клетки, когда ее в том же виварии поставили в другое место, что – абсолютно безосновательно – было истолковано как попытка удалить, «спрятать вещественные доказательства». Для того чтобы реабилитироваться, позднее мне разрешили приготовить обратную транскриптазу, которую вместе с другими (рибосомными) белками, поставленными институтом, должны были доставить на околоземную орбиту, чтобы посмотреть, как происходит процесс кристаллизации в условиях пониженной гравитации. К сожалению, эксперимент закончился неудачей. Как выяснилось намного позже, кристаллизация происходит только в том случае, если фермент зафиксирован в определенной структуре специальным препаратом. А в моем случае он был слишком «гибким»! Кристаллы необходимы для разработки противовирусных препаратов.
Позднее в своей исследовательской деятельности мне приходилось сталкиваться с тем, что люди боятся нашей работы. Так было в случае с гриппом, ТОРС и вирусом рака, поскольку заражались не только коллеги, но и их сослуживцы, и часто мужья и жены. Подозрительность была вполне оправданна, поскольку действительно было несколько инцидентов – в Китае, например, из лаборатории с высокой степенью биозащиты пропадал вирус ТОРС (три раза!); кроме того, однажды исчезло несколько лабораторных лягушек ( и это стало огромной проблемой в Калифорнии.
ОТ – специфическая характеристика ретровирусов, что удивило ученых, поскольку никто не ожидал, что РНК может транскрибироваться в ДНК для репликации. Это привело к пересмотру «центральной догмы» молекулярной биологии, согласно которой биосинтез ДНК – РНК – белок происходит в ходе двух последовательных процессов, транскрипции и трансляции соответственно. Хоуард Темин и независимо от него Дэвид Балтимор показали, что возможен и обратный процесс: ДНК может биосинтезироваться из РНК. Такую реверсивную транскрипцию впоследствии назвали «обратной» транскрипцией, в силу чего фермент получил название «обратная транскриптаза». (
Открытие реверсивного (обратного) потока информации стало большой неожиданностью для ученых. Следовательно, ДНК может интегрироваться в ДНК генома клетки-хозяина и передаваться на протяжении всего жизненного цикла клетки при делении как клеточный ген. Ретровирусы обычно не вызывают лизис своей клетки-хозяина и не уничтожают ее, они «отпочковываются» от клеточной мембраны. Если исходить из того, что в процессе эволюции сначала появилась РНК, а потом ДНК, то понятие «обратная транскриптаза» окажется некорректным. Шаг от РНК к ДНК носит не реверсивный, а прямой характер. Строго говоря, правильно было бы назвать это явление «реальная транскриптаза»! В этом случае даже не пришлось бы менять сокращенное название на английском языке (RT)[9], однако никто в таком изменении не заинтересован.
В настоящее время, когда, фигурально выражаясь, все возможные геномы секвенированы, самое большое удивление вызвало количество находящихся вокруг нас обратных транскриптаз. Они присутствуют во многих организмах, во всех эукариотах (животных и растениях), а также в археях, бактериях, ретротранспозонах, сплайсосомах и в странных химерных мультисателлитных ДНК (msDNA), а также в иммунной системе человека и бактерий. У одних только бактерий существует более 1000 различных видов обратных транскриптаз. Для чего они предназначены? В клетках млекопитающих нам известны ретротранспозоны, которые кодируют эти обратные транскипты, необходимые для действия механизма «копировать и вставить» клеточной ДНК, который будет описан ниже (ретротранспозоны напоминают упрощенный вариант ретровирусов). В 1978 г. один из ученых, открывших обратную транскриптазу, Дэвид Балтимор, организовал встречу, на которой кто-то из участников охарактеризовал существование обратной транскриптазы у мух: «Насколько мне известно, в организме мух нет ретровирусов». И лишь в настоящее время, много времени спустя, нам стало известно, что у мух тоже есть обратная транскриптаза, источником которой являются не ретровирусы, а их родственники, ретротранспозоны – предшественники или процессированные «деформированные» ретровирусы, которые широко распространены и существуют, в частности, у мух. Они чрезвычайно широко распространены. Так уж случилось, что ретровирусы как частный случай были открыты первыми!
Итак, мы выяснили, что обратные транскриптазы связаны не только с ретровирусами. Поскольку фаги, которые по большей части содержат ДНК, тоже относятся к вирусам, можно себе представить, что в процессе эволюции они в свое время имели РНК и только позднее ДНК-геномы, а в промежутке обладали ретровирусоподобными свойствами. То есть вполне можно ожидать открытия и «ретрофагов». Я сформулировала эту идею. Но, насколько мне известно, несмотря на интенсивные исследования, в которых я тоже участвовала, существует только один «ретрофаг», являющийся прибежищем одной из обратных транскриптаз (см. ниже).
Известно, что обратная транскриптаза – ключевой фермент в биологии. Вероятно, фермент ОТ даже в первую очередь «изобрел» ДНК и, безусловно, сыграл важную роль в формировании геномов, включая наш собственный, в процессе эволюции, которая насчитывает, как сейчас признано, более 100 млн лет. Возможно, изначально существовал более простой и примитивный предшественник ОТ. Я подчеркиваю значимость обратной транскриптазы не (только) потому, что я специалист именно по данному ферменту и сужу пристрастно, а еще и потому, что есть новые свидетельства очень важной роли этого фермента, который является одним из наиболее распространенных белков и даже ведущим ферментом в проекте по изучению образцов, забранных из океана, и составляет 13,5% всех содержащихся в планктоне белков, даже через 45 лет. А почему? Ретровирусы, ретротранспозоны, механизм «копировать и вставить» подходят друг к другу и формируют геномы, стимулируя эволюцию. ОТ – молекула номер один, равно как и РНКаза Н, о которой речь пойдет в следующей главе.
