Вирусы против вирусов
Принцип генной терапии очень прост: природа предоставляет нам вирусы, способные быть носителями онкогенов, а вирусологи заменяют онкогены терапевтическими генами. Таким образом, онкогенные вирусы являются болезнетворными, а терапевтические оказывают лечебное действие. Генная терапия использует принцип, которого придерживаются все вирусы, – перенос генов. В этом заключается основная роль вирусов в процессе эволюции.
Вирусы столь успешны в индуцировании болезней, потому что они размножаются в организме до астрономических чисел, – и вот тут-то возникает проблема, поскольку размножение терапевтических вирусов недопустимо. В этом смысле терапевтические вирусы преуспели гораздо меньше. Такое ограничение задается самим человеком, поскольку реплицирующиеся вирусы могут оказаться опасными. Они могут проникнуть в половые клетки и передаться будущим поколениям. Мы не берем на себя смелость манипулировать генами наших потомков, никому не хочется, чтобы это произошло. Довольно сложно разработать вирусы, которые не реплицировались бы при любых условиях, поскольку вирусы «учатся» очень быстро и часть их может «сбежать». Производимые вирусы должны быть безопасными. В большинстве случаев для целей генной терапии применяют ретровирусы. Однако можно модифицировать и большое количество других вирусов и синтетических вирусов. Вирусы, используемые для генной терапии, являются сложными «дизайнерскими вирусами».
При инфицировании нормальной клетки опухолевый вирус превращает такую клетку в опухолевую, но возможен и обратный процесс – опухолевую клетку можно обработать вирусом – носителем терапевтических генов с целью «излечения» такой клетки, в результате чего она становится нормальной. Терапевтический ген должен быть способен компенсировать мутации, обусловившие злокачественный фенотип опухолевой клетки. Генная терапия может быть показана и для лечения других генетических или метаболических заболеваний. Сложно найти правильный ген и наиболее подходящий вирус. Что касается применения любого вируса, всегда есть определенные за и против. Ретровирусы до сих пор являются наиболее тщательно изученными из всех вирусов, которые можно использовать в качестве терапевтических. Они незаменимы для переноса генов в клетки, особенно в лабораторных условиях. В мире не существует ни одной биомолекулярной лаборатории, где ретровирусные векторы не использовались бы в качестве повседневного инструмента для переноса генов. На самом же деле это не совсем так, поскольку для этого нужна лаборатория второго уровня биобезопасности. Мы располагали помещением, отвечающим таким требованиям, поэтому могли синтезировать широкий спектр различных вирусов для своих коллег. Ретровирусы интегрируются в геном хозяина, что рассматривалось как одно из важных преимуществ, поскольку от вирусов ожидали долговременной эффективности. И все же их эффективность не всегда является долгосрочной, и такие вирусы могут представлять опасность, поскольку интеграция в геном часто представляет собой генотоксическое явление, вызывая локальное повреждение ДНК, которое может индуцировать развитие рака как отдаленное последствие терапии. Поэтому лечение рака может вызвать развитие других видов рака. Но даже при этом подобная терапия позволяет пациенту выиграть время и улучшить состояние здоровья.
Совершенно неожиданно результаты доклинических исследований ретровирусов показали, что экспрессия терапевтических генов не всегда носит долгосрочный характер и со временем угасает, несмотря на интеграцию. Это вызвано реакцией организма на инородный ген и ведет к его отключению. Явление, при котором «инородные» гены инактивируются противовирусной защитой, называется сайленсингом. Защита обусловливает эпигенетические изменения, направленные на инактивацию генов, что было описано при исследовании генов цвета у кукурузы и мышей (э). Данный механизм сайленсинга, очевидно, носит более выраженный характер у взрослых, поскольку применение генной терапии с использованием ретровируса для лечения детей с гранулематозом (заболевание кровеносных сосудов) привело к их исцелению, в то время как один взрослый пациент через два года умер. В такие исследования включается очень незначительное число пациентов, и объем статистических данных не удовлетворяет соответствующим требованиям. Однако вполне возможно, что терапевтический эффект у детей более долгосрочный, чем у взрослых.
Существуют альтернативные варианты: вместо того чтобы замещать гены, пораженные заболеванием, генную терапию можно проводить путем стимуляции иммунной системы пациента, чтобы помочь ему бороться с опухолью, то есть «помочь людям помочь себе». Иммунная терапия может предусматривать использование генов, кодирующих цитокины, что приводит не к местному, а к системному эффекту. Мы использовали такой фактор, интерлейкин 12 (еще его называют фактором, стимулирующим Т-клетки), который активирует клетки-киллеры, повышая уровень некоторых типов интерферона, – это целая комбинация компонентов, направленных на борьбу с раком.
Самое важное ограничение в плане использования вирусов заключается в том, что они не должны реплицироваться. Вирус не должен переходить из одной клетки в другую.
Каждая клетка – тупик для терапевтического вируса, он может в нее войти, но не может выйти. Вирусы следует вводить в соматические клетки – особенно раковые и в клетки, пораженные заболеванием, – чтобы уничтожить или излечить их, но нельзя допустить, чтобы эти вирусы оказались в кровотоке, откуда они случайно могут попасть в половые клетки и передаться следующим поколениям. Шанс попадания вируса в половые клетки повышается, если вирус активно реплицируется. Такое развитие событий строго запрещено, и изначально это пошло от ученых-исследователей, придерживающихся принципа самоограничения. В настоящее время соответствующими регуляторными органами введены строгие правила . При отсутствии репликации для каждой опухолевой клетки требуется по одному терапевтическому вирусу. Это сложно. Размер опухоли определяется в кубических сантиметрах (это 1 мл или примерно 1 г), в каждом содержится около 10 клеток. Следовательно, если каждый вирус обнаруживает одну клетку, для лечения такой опухоли потребовалось бы как минимум 10 вирусов. Однако возможна выработка не более чем 1/100 или 1/1000 от этого числа (20 млн вирусов в 1 мл). Поэтому потребуется слишком большой объем введения, и, кроме того, вирусы достигают не всех опухолевых клеток. Это объясняет ограничения генной терапии с использованием вирусных векторов, так как для обеспечения эффективности необходима репликация вирусов. Именно для этого их и создала природа. Более того, невозможно добраться до каждой из клеток, поэтому всегда имеет место «минимальное остаточное заболевание». Если сохраняется даже немного раковых клеток, этого зачастую бывает достаточно для увеличения их числа и возвращения опухоли.
Чтобы не допустить производства способных к репликации вирусов, их часто разрезают на части, их гены фрагментируют на 3–4 субвирусные генетические части вместо одной, а затем «упаковывают» в вирусную частицу. Эти части состоят из плазмидной ДНК, и каждая из них может кодировать ограниченный комплект генов. Лентивирусы были созданы для замены более простых ретровирусов. Они являются родственниками ВИЧ. На первый взгляд это кажется устрашающим, но только для читателя и для регуляторных органов. У лентивирусов есть определенные преимущества, поскольку они проявляют активность в неделящихся клетках (в частности, в нейронных клетках). Их можно сделать безопасными. Существуют способы обеспечить такую безопасность путем удаления некоторых генов вирусов или фрагментации и поиска разумных способов предотвратить их превращение в полноценный инфицирующий вирус. На какое-то время эти фрагменты можно соединять и использовать для инфицирования опухолей, и при этом каждая частица поражает одну клетку. Эту систему разработал лауреат Нобелевской премии Дэвид Балтимор из Калифорнийского технологического института (Пасадена).
Студент из Берлина, проходивший летнюю практику в Цюрихе, очень удивил меня вирусом Балтимора. Он просто написал Дэвиду в США и попросил у него терапевтический вирус, а затем без каких-либо проблем привез его в рюкзаке. Я была потрясена! Мы, как полагается, поместили вирус в помещение с надлежащей системой безопасности. Вероятнее всего, наличие на коробке печатного фирменного бланка с моим именем и послужило бесплатным билетом!
Еще одна сложность генной терапии заключается в способе обнаружения вирусом опухолевой клетки в организме. Можно попытаться использовать гиподермическую иглу и ввести суспензию прямо в опухоль или в пространство вокруг нее. Такой способ оказывается эффективным лишь в отношении некоторых опухолей. Мы вводили терапевтические плазмидные ДНК в злокачественные меланомы, которые формируют локальные кожные опухоли. Побочные действия такой терапии для пациентов оказываются менее выраженными, а локальная доза выше системной дозы, которая, попав в кровь, перемещалась бы по всему организму. Однако данная терапия бесполезна против генерализированных метастазов, которые мигрируют в удаленное местоположение. Можно попытаться направить вирус на какую-нибудь дистантную опухоль или метастатическую клетку, используя поверхностные маркеры, своего рода молекулярный адрес. Это принцип идентичен принципу, созданному природой для направления вируса на соответствующую клетку-мишень. ВИЧ распознает свою клетку-мишень по рецептору, находящемуся на поверхности лимфоцитов, для чего задействуется поверхностный гликопротеин вируса gp120, лиганд рецептора – очень ограниченный входной билет для вируса.
Разрабатываются альтернативные подходы. Один из них заключается в изоляции опухолевых клеток, лечении их вне организма, получении в лабораторных условиях большего количества излеченных и подвергнутых соответствующей обработке клеток и последующем их возвращении в организм пациента. Такой метод является более безопасным и эффективным, чем терапия.
Интеграция любого ретровируса всегда опасна, поскольку сайты интеграции возникают произвольно, а их модификация может нанести ущерб или повредить клеточные гены. Это явление называется «инсерционный мутагенез» или «инсерция промотора» (имеется в виду сильный вирусный промотор), что может привести к развитию рака. Таким образом, лекарственные препараты могут вызвать рак. Именно это наблюдалось у некоторых детей с иммунодефицитом. Алан Фишер из Парижа лечил 18 детей, используя ретровирусный вектор, который экспрессировал фактор роста для терапии наследуемого иммунодефицита, «аденозиндезаминазной недостаточности». Из-за этого дефицита пациенты становятся настолько восприимчивыми к инфекции, что вынуждены жить в стерильных условиях. Применение генной терапии привело к излечению 16 пациентов, но вместе с тем и к развитию опасного инсерционного (вставочного) мутагенеза у оставшихся двух пациентов, причем вирусный промотор индуцировал у детей лейкемию (к счастью, это состояние можно контролировать). Таким образом, генная терапия сопряжена с определенным риском.
Еще одним шагом вперед является разработка индуцируемых ретровирусных векторов. Их по желанию можно включать и выключать путем добавления или удаления регуляторных соединений (например, антибиотика тетрациклина). Таким образом можно повлиять на активность вируса или даже контролировать дозу продуктов, содержащих терапевтические гены. Это может снизить токсичность и прочие побочные эффекты. Некоторые рекомбинантные вирусы после выполнения своих функций самоуничтожаются за счет так называемого процесса «самоинактивации» (SIN).
Существуют индуцированные интерфероном гены, которые мой коллега Йован Павлович (студент Джина Линденманна, ученого, открывшего интерферон) разработал в Институте медицинской вирусологии (Цюрих). Это стало предметом интенсивных исследований Фонда Volkswagen, проводимых на модели выводимых трансгенных мышей. У этих мышей с помощью интерферона можно включать и выключать гены. Для разведения таких мышей требуется около трех лет, и для моих коллег это было не очень привлекательно. Между тем разработан новый и высокоэффективный способ – CRISP/Cas9. В настоящее время выращивание таких мышей – дело нескольких недель.
Понимание механизма формирования опухоли до сих пор остается исследовательским проектом, особенно что касается модели трансгенных мышей. Остается открытым вопрос, как онкогенные белки Ras и Myc комбинаторно индуцируют развитие опухоли? В 2015 г. этот вопрос все еще оставался без ответа, несмотря на то, что уже более 30 лет известно, что тандем этих двух онкогенов является выраженным «возбудителем» рака. Это крайне удивительно. У мышей два этих сильных онкогена не обязательно вызывают развитие рака, и никто не знает, почему так происходит. Каких факторов не хватает? Это ставит под сомнение использование мышей в качестве животной модели для изучения опухолей.
Для использования в целях генной терапии помимо ретровирусов разрабатываются аденовирусы. Их преимущество заключается в способности инфицировать большое число разных типов клеток-хозяев и не интегрироваться, что обусловливает отсутствие генотоксического побочного эффекта. Их можно выращивать до высоких концентраций – 10 вирусов на 1 мл, для достижения более выраженного терапевтического эффекта. В 1999 г. в Филадельфии, в начале эры использования генной терапии молодому пациенту с нетерминальной стадией заболевания проводили генную терапию с использованием аденовирусов. Врачи назначили ему до 10 вирусных частиц в надежде, что чем выше доза, тем лучше окажется результат. Но произошло обратное: мальчик Джесс Гельсингер умер от избыточной реакции иммунной системы, так называемого «цитокинового шторма», поскольку у него уже выработались собственные антитела против терапевтического вируса. Вся область генной терапии испытала потрясение, а ведущий исследователь был отстранен от обязанностей. Исследователи извлекли из этого случая следующий урок: лечение терапевтическими вирусами следует назначать пациентам, ранее не получавшим соответствующие препараты, то есть не имеющим антител к таким вирусам.
Большинство людей всю жизнь сталкиваются с аденовирусными инфекциями без вреда для здоровья и являются носителями антител, в частности антител, которые вступают в противоречие с этой терапией. Поэтому в настоящее время врачи назначают аденовирусы не человека, а скорее приматов, поскольку большинство людей с ними не сталкивается. До недавнего времени использовали адено-ассоциированный вирус (ААВ). Выбор пал именно на этот вирус по причине его способности специфически интегрироваться на одном сайте хромосомы 19, то есть была исключена неспецифическая интеграция и все сопряженные с ней риски. К сожалению, вектор ААВ часто теряет именно это преимущество, но тем не менее его продолжают разрабатывать как многообещающий вектор.
В исследовании рака в последнее время лидерами являются онколитические вирусы, которые инфицируют, реплицируются и лизируют только опухолевые клетки (о чем свидетельствует их название). В нормальных клетках репликации не происходит, и они остаются здоровыми. Кроме того, убитые опухолевые клетки высвобождают большое количество вирусов. Поэтому такой подход позволяет решить вышеупомянутую проблему – репликацию дефектных вирусов. Возможна инъекция онколитических вирусов, после чего они находят опухоль или метастатические клетки в организме. К тому же сам по себе вирус является стимулом для иммунной системы в качестве дополнительной иммунной терапии. Уже продолжительное время появляются сообщения о единичных случаях излечения в результате применения «виротерапии», при которой на фоне неспецифических вирусных инфекций или применения вакцин отмечалось улучшение симптоматики не связанных между собой заболеваний. Данную терапию не понимали и в один прекрасный момент забросили, но сейчас она возвращается как один из компонентов терапии с использованием онколитических вирусов.
Использование онколитических вирусов против раковых клеток – оригинальный подход, который изучается во многих лабораториях. Фрэнк Маккормик разработал его примерно 20 лет назад в своей компании Onyx, используя генетически модифицированные аденовирусы, которые реплицируются и лизируют только опухолевые клетки, несмотря на то, что инфицируют и нормальные клетки, в которых не могут реплицироваться как обычно. Фокус заключается в том, что терапевтический вирус становится чувствительным к супрессорам опухоли в нормальных клетках, чего в любом случае не происходит в самих раковых клетках.
А между тем в настоящее время проводится примерно 20 клинических исследований, даже в относительно безнадежных случаях, в частности при опухоли головного мозга и поджелудочной железы. Несколько лет назад в Китае разрешили к применению препарат для лечения рака головы и шеи. 2016 г. – ориентировочный срок выдачи регистрационных удостоверений на препараты для терапии злокачественной меланомы. В Немецком центре исследований рака в Гейдельберге разрабатывается метод с использованием вирусов кори. Возможно использование и других вирусов, в частности парвовирусов, полиовирусов или модифицированных герпесвирусов, которые являются онколитическими. Давайте надеяться и верить, и посмотрим, что произойдет.
Биофармацевтическая компания Amgen обогатилась в результате продажи эритропоэтина, который индуцирует репликацию предшественников эритроцитов. Наряду с узаконенным применением эритроциты зачастую используются в спорте в качестве допинга. Amgen приобрела Onyx за несколько миллиардов долларов и является первой компаний, получившей разрешение на работу с онколитическими вирусами.
Onyx занимается разработкой ингибиторов киназы Raf для лечения рака прямой кишки. Недавно она получила внушительный грант на разработку онкогена Ras – направление, где еще никому не удалось добиться успеха, несмотря на огромные расходы и десятки лет, потраченные многими фармацевтическими компаниями. Мутированный Ras – один из наиболее часто встречающихся онкогенов при раке, но у него так много нисходящих мишеней, что любое лечение, предусматривающее использование этого онкогена, до сих пор было сопряжено с побочными явлениями. Потребуются комбинации различных лекарств – двойная или тройная терапия.
«Крупные фармацевтические компании поглощают мелкие биотехнологические фирмы» – это стало новой стратегией. Она приемлема для мелких фирм, которые не могут разработать препараты для клинического применения и выполнить все нормативные требования, притом что затраты составляют миллиарды долларов. Поэтому мелкие биотехнологические компании предпочитают, чтобы их поглотили крупные фармацевтические фирмы, и рассматривают это как рентабельную стратегию, дающую быстрый результат. Мелкие компании отличает более выраженная инновационность, способность проводить более гибкую политику, б?льшая готовность и способность рисковать, выигрывать и проигрывать, в то время как крупные компании претерпевают «мутации», превращаясь в инвестиционные институты, которые ограничивают объем научных исследований, – вероятно, сейчас достаточно просто отслеживать новые разработки на рынке, чтобы принимать обоснованные решения по вопросу поглощения соответствующих компаний!
Начинания Фрэнка Маккормика неоднократно приводили к успеху. Он был основным докладчиком на первой конференции по биотехнологиям, которую я организовала в Цюрихском университете. Я знаю его с тех пор, как стала исследователем в Обществе Макса Планка в Берлине, а он работал по совместительству в американской биотехнологической компании. Мои цюрихские коллеги сетовали на то, что не были первыми! Когда я организовала это мероприятие, все очень боялись биотехнологий, опасались влияния коммерции на науку, что предусматривает вовлечение в этот процесс денег и пациентов. Наука привыкла быть открытой для огласки, свободной, не связанной никакими ограничениями, а неразглашение результатов исследований считалось неприемлемым. Помню, как в новой форме заявки на грант Швейцарского национального научного фонда появился последний пункт: «Как вы планируете использовать результаты своих исследований на практике?» Мои коллеги не понимали сути вопроса, так как совершенно не думали о применении результатов своей работы в разработке препаратов! В то время об этом ничего не знали в области биомедицины, но в инженерии и химии это уже стало нормой. В настоящее время любой человек практически в любом университете может ежегодно участвовать в конкурсах для отделившихся компаний на получение поддержки. Учрежденная Маккормиком биотехнологическая компания была одной из наиболее успешных. Мы учились у него, но, вероятно, не настолько усердно, чтобы стать такими же успешными.
