Вирусы для выявления вирусов – ПЦР
Обратная транскриптаза имеет большое значение не только для репликации ретровирусов и функционирования механизма «копировать и вставить», который действует в наших ДНК-геномах, но еще и в повседневной работе исследовательских лабораторий. Обратная транскриптаза играет важную роль в осуществлении полимеразной цепной реакции, системы амплификации. Эта система напоминает упрощенную репликацию вируса в пробирке, где происходит экспоненциальная амплификация генов. Эта технология стала революционным событием в области диагностики, поскольку до сих пор остается наиболее чувствительным методом выявления нуклеиновых кислот в микроорганизмах, вирусах, бактериях, опухолевых клетках, образцах любых тканей, ископаемых останках, мумиях, шерсти вымерших бизонов и т.д. Можно выявить даже мутации – единичные генетические изменения. Часто во время обычных посещений врача ПЦР проводится в целях диагностики либо мониторинга статуса заболевания или же реакции организма на терапию, поскольку эта реакция чрезвычайно быстро дает результаты. Получить несколько миллиграммов образца вполне возможно, и этого объема достаточно для проведения окрашивания – метод, который позволяет «увидеть» амплифицированную ДНК. Затем амплифицированная ДНК подвергается дополнительному анализу (секвенирование). Возможны варианты: если исходный материал представляет собой РНК, тогда применяется обратная транскриптаза для получения ДНК – так же, как для репликации ретровируса. Количество РНК отражает активность гена, что является информативным показателем, используемым в исследовательских и медицинских целях. Не соответствующая норме экспрессия может служить признаком заболевания. Поэтому важно провести количественную ПЦР с детекцией в реальном времени, и этот аналитический метод используется очень часто. Такой анализ называется «профилирование экспрессии» и проводится для определения активности всех генов клетки. Он характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью: например, в контексте ВИЧ вирусная нагрузка может определяться на очень низком уровне – 20 вирусных копий на 1 мл. Именно это в газетах называется «излечение», однако на самом деле речь идет не о реальном излечении, а о снижении количества вирусов до неопределяемого уровня. За счет использования технологических приемов удается ускорить реакцию и сделать ее более специфической, а термостабильные ферменты, предназначенные для реакции копирования, позволяют осуществлять полностью автоматическую амплификацию. В Йеллоустонском национальном парке такие ферменты обнаружили в гейзере с температурой воды 60 °С, но потом их стали находить во многих других термальных источниках. Говорят, что один ученый, желая получить термостойкие бактерии из такого термального источника для выделения термостабильной ОТ, поскользнулся на краю кратера и в результате потерял ногу. Если это правда, это очень печально. Этот фермент называется Taq-полимеразой, где Taq означает термостойкую бактерию
Этот метод настолько чувствительный, что позволяет амплифицировать нуклеиновые кислоты из столь малого количества, что они могут оказаться «ни при чем» или не связаны с заболеванием – тем не менее! Поэтому сверхчувствительность метода может быть контрпродуктивна, а слепая вера в него – неправомерна и даже опасна. На самом деле мы не знаем, может ли наша иммунная система удалить незначительное число патогенов или даже раковых клеток, чтобы мы никогда не заболели, но это можно выяснить с помощью ПЦР, и это нас беспокоит.
Однако этот метод действительно помог нам найти утечку опасных фрагментов ДНК ВИЧ в одном из ламинарных боксов, которые попали туда из пробирок. А поскольку мы разрабатывали вакцину от ВИЧ на основе ДНК, то оказались вакцинированными ДНК, находившимися в лабораторном воздухе. При помощи ПЦР удалось найти утечку. Есть еще один недавний, более известный пример: с помощью ПЦР удалось идентифицировать английского короля Ричарда III по останкам из могилы, находящейся под парковкой в Лестере, сравнив ДНК этих останков с ДНК ныне здравствующих членов королевской семьи. Для восстановления филогенетических деревьев мамонтов достаточно шерсти, а для реконструкции миграционных путей первых ископаемых гоминидов вполне достаточно небольших костных образцов. Можно даже реконструировать пищу через несколько тысяч лет. Так же как можно обнаружить микроорганизмы в смоге Нью-Дели или Пекина. ПЦР радикально изменила процесс поиска преступников и убийц, и в настоящее время для определения личности достаточно буквально капли биологической жидкости или волоса. Все это стало возможно благодаря ПЦР.
Этот метод вызвал споры, поскольку несколько ученых претендовали на его открытие. Потом о нем забыли, а позднее открыли снова и усовершенствовали. Это был последний прорыв. Патентообладателем на данный метод является компания Hoffman La Roche, которая и получает роялти, но в научных целях этим методом можно пользоваться бесплатно. Изобретатель этого метода – человек необычный. После того как он несколько лет разрабатывал данную технологию в Cetus Co., его уволили из компании. Как мне рассказывали, ему заплатили $10 000, а продали эту технологию Hoffman La Roche за $300 млн. И все же справедливость наконец восторжествовала и эксцентричный изобретатель Кэри Муллис в 1993 г. получил Нобелевскую премию за открытие в области химии. Выступая с речью на церемонии вручения премии, он с сожалением сказал, что Нобелевская премия разрушила его отношения с девушкой! писала, что его метод разделил биологию и медицину на две эпохи – до и после изобретения ПЦР.
