Рот: множество микробиомов в одном
Полость рта, где много лет назад началось исследование микробиома человека, до сих пор служит зоной и самых простых, и самых сложных исследований. Итак, рот продолжает всех удивлять, что блестяще продемонстрировал с помощью ДНК-анализа первопроходец микробиологии Дэвид Релман.
Начнем с простого. Что может быть проще поцелуя? Однако в микроскопическом масштабе лобзание – штука довольно сложная. Исследование 2014 года, в шутку названное «Микробиом влюбленных», показывает интенсивность микробного переноса при самых разных чмоканьях – от ритуального клевка в щечку до более интимных шалостей. Группа голландца Ремко Корта опросила 21 парочку, интересуясь тем, как и насколько часто те целуются, и вовлекла целующихся в эксперимент, при котором один из партнеров пил между поцелуями пробиотический йогурт. Подтвердилось то, что вы наверняка и так предполагали: поцелуй – отличный способ передать бактерии, живущие на языке любителя йогурта, партнерше. Как сообщают ученые, при десятисекундном поцелуе передается около 10 миллионов бактерий[42].
Однако результаты поцелуев в долгосрочной перспективе куда сложнее – как в человеческих отношениях, так и в микробиологическом смысле. Состав микробов на поверхности языка действительно более схож у партнеров, чем просто у случайно выбранной пары людей, однако сходство это не так уж сильно зависит от того, насколько часто парочка целуется. Прямой перенос ведет к возникновению устойчивых популяций одних бактерий, но не других. Видимо, на процесс отбора здесь влияет целый ряд иных факторов. Поцелуи оказывают свое воздействие, но последнее слово все равно остается за экосистемой.
Ведутся и более трудоемкие исследования орального микробиома. Уместно вспомнить одну программную статью, где этому микробиому уделяется особое внимание. Она вышла в середине 2014 года, и в ней по-новому использованы результаты старых изысканий. (Открытия в биологии всё чаще совершаются именно так.) Уже изученные ДНК-последовательности хранятся в базах данных, к которым могут обратиться все желающие. Компьютерные кудесники порой ставят новые вопросы, ответы на которые можно получить из уже имеющегося массива информации.
Мурат Эрен из Лаборатории морской биологии, располагающейся в массачусетском городке Вудсхол (сегодня эта оснащенная по последнему слову техники лаборатория занимается далеко не только биологией моря), задался вопросом: может быть, повторный анализ данных, полученных в рамках проекта «Микробиом человека», только выиграет, если учесть информацию о типах бактерий, выясненную при анализе собранных образцов?[43] Для примера взяли фрагмент базы данных ДНК-последовательностей и информацию, касающуюся микробов из американских ртов. И в самом деле, работа принесла результат.
В этих ртах таится много неведомых бактерий, поскольку базовый 16S рРНК-анализ при всей невероятной полезности имеет свои ограничения. В частности, отыскивая ярко выраженные бактериальные типы путем сравнения некоторых гипервариабельных участков генов, этот метод отбирает лишь немногие участки, устанавливая своего рода порог для определения того, что следует считать отдельным видом (или операционной таксономической единицей). Последовательности, отличающиеся в этом отношении меньше чем на 3 %, считаются одинаковыми.
Такая процедура помогает избегать завышенной оценки уровня разнообразия, поскольку при секвенировании постоянно происходят небольшие ошибки. Однако в результате мы сваливаем в одну кучу некоторые микроорганизмы, различающиеся по немаловажным параметрам. Эрен заново рассмотрел старые данные, используя более действенный подход, направленный на поиск «наиболее информационно насыщенных нуклеотидных позиций» в наборе 16S рРНК. Его метод рассуждения базируется на теории информации и энтропии, созданной в 1948 году Клодом Шенноном. Мы можем рассматривать этот метод просто как применение сети с более мелкими ячейками при рыбалке в пруду, где плавают всевозможные генетические последовательности.
Ячейки оказались столь мелкими, что выделенные благодаря им новые бактериальные разновидности (теперь они именуются олиготипами, а не операционными таксономическими единицами) могут различаться в одном определенном гене всего лишь на одну пару нуклеотидных оснований ДНК из 1500.
Команда Эрена выбрала для обкатки своего метода именно оральный микробиом, поскольку интенсивное изучение микрофлоры рта уже дало обширный массив систематически организованной информации. Это одна из наиболее тщательно изученных групп нашего микробного населения. Многообразие жизни у нас во рту можно в полной мере оценить, обратившись к базе данных «Оральный микробиом человека», где, по состоянию на 2014 год, насчитывалось 688 видов (определение виду давалось через последовательности 16S рРНК). Целых 440 из них удалось вырастить в культуре – самая высокая доля среди всех участков тела, поскольку во рту меньше анаэробных бактерий (не выносящих присутствия кислорода), чем, к примеру, в кишечнике. У нас даже есть полные геномные последовательности для 347 из них. Самое давнее место исследования наших микробов ученые успели довольно подробно изучить. Однако новые, более изобретательные способы отсеивания данных показывают, что микрофлора рта еще многое способна поведать.
Эта новая процедура анализа состояла из двух основных стадий. Данные проекта «Микробиом человека», набор из 10 миллионов «показаний» для двух отдельных коротких участков гена 16S, классифицировали по олиготипам (490 на одном участке и 360 – на другом). Затем эти олиготипы сопоставили с полными последовательностями из более богатой базы данных «Оральный микробиом человека».
Оказалось, что олиготипы – то же, что и виды. Так ли это? На этот вопрос нет простого ответа, точно так же, как и на вопрос: что такое вообще «вид» у микробов? Какой же тогда смысл можно извлечь из всех этих данных? Видите ли (вздохнем поглубже), некоторые олиготипы (около 15 % общего числа) оказались не отличимыми от некоторых видов, описанных в каталоге. Некоторые группы из двух и более видов оказались не отличимыми по олиготипу. И (главный вывод, ради которого стоило затевать исследование) более 150 видов из базы данных принадлежали к множественным олиготипам, тем самым – по меньшей мере – повышая вероятность того, что исходная классификация видов пренебрегает существенными различиями. Еще 86 олиготипов, похоже, не описывали ни одно из существ, данные о которых содержались в базе «Оральный микробиом».
В этом немаловажный урок для всех, кто берется оценивать микробиомные исследования. То, что вы находите, зависит от того, где вы ищете. Возможно, скрытые от нас уровни разнообразия еще ждут своего обнаружения. Изучение микробиома при помощи алгоритмов, позволяющих обрабатывать гигантские массивы данных о генетических последовательностях, чем-то напоминает выслеживание животных в джунглях при помощи бинокля с линзами, пропускающими лишь лучи с узким диапазоном длин волн – только одного цвета из всего спектра. Поставив линзы, настроенные на другой цвет, вы увидите другой набор обитателей леса, хотя он и будет в чем-то перекрываться с тем, который вы уже видели через первую пару линз.
Из такого анализа можно сделать и другие выводы. Разнообразие, открываемое путем классификации на олиготипы, действительно играет важную роль; в этом нас больше всего убеждает то, что различные олиготипы микробов, кажущихся весьма похожими, обитают в разных местах. Отсюда наверняка можно узнать что-то новое об экосистеме, хотя пока и не очень понятно, что именно. Проверьте биоматериал более двух сотен человек, представленный в проекте «Микробиом человека», и может оказаться, что во всех пробах, взятых с языка, присутствует один олиготип, а в пробах, взятых с зубов, неизменно присутствует другой. Иногда бактерии, живущие, как правило, в разных местах, отличаются лишь на пару нуклеотидов в гене 16S.
Эрен проявляет очаровательную искренность, совершенно не скрывая того факта, что биологическую значимость таких данных нам еще предстоит выяснить[44]. Он обращает особое внимание на два организма, различающихся по распределению. Один – уже идентифицированный вид F. periodonticum, важный для науки, поскольку связан с воспалительным заболеванием десен. Другой достаточно сходен с ним, чтобы носить такое же название, однако с кое-каким довеском: «F. periodonticum 98,8 %». Как объясняет Эрен, это временное наименование как бы говорит: «F. periodonticum – самое близкое к этой штуке существо в базе данных, но все-таки перед нами явно два разных существа».
Как предполагают ученые, такие малые различия в 16S рРНК сопровождаются большими отличиями в других генах, а значит, и в том, как и где способны жить эти бактерии. Для подтверждения этой гипотезы следует внимательнее исследовать индивидуальных микробов. А поскольку микробов для исследования теперь больше, само расширение массива соответствующей информации заставляет оральный микробиом выглядеть еще более сложной системой.
По части разнообразия этот микробиом уже сейчас получает высокие баллы. Все 12 микробных филумов (11 филумов бактерий и 1 филум архей), обнаруженных у человека, найдены и во рту, где насчитываются сотни, а то и тысячи видов. Самое большое количество различных видов обнаружено в области зубов и поддесневых карманов, однако свои сообщества имеются и в других областях рта (или близких ко рту) – в горле, на миндалинах и языке.
Более подробные исследования выявили ключевые аспекты нашего взаимодействия с некоторыми из весьма значимых видов микробов, особенно обитающим на зубах. Некоторые из них, особенно представители рода Streptococcus, специфично связываются с белками или углеводами, находящимися в покрывающем зубы тонком слое смеси, которая состоит из слюны и жидкости, выделяющейся из поддесневых карманов. Едва захватив новую территорию, эти микробы уже сами предоставляют участки для связывания колонистам второй и третьей волны. В итоге поверхность зуба покрывает комплексная биопленка взаимодействующих бактерий. Целая отрасль медицинской и бытовой промышленности занимается удалением этой пленки и даже полным устранением оральных бактерий (в качестве меры профилактики кариеса). Специалисты строят всевозможные гипотезы насчет связей между той или иной частью человеческого микробиома и возникновением заболеваний. Такие связи порой кажутся весьма зыбкими. Однако в данном случае связь выстраивается самая ясная: нам известно, что бактерии биопленки действительно разрушают зубную эмаль, производя кислоту из сахара. Однако преимущества микробиомной науки станут очевиднее, если благодаря ей мы научимся лучше понимать экологию таких сообществ и сумеем разработать более тонкие методы сохранения зубов, чем полоскание или чистка антибактериальной пастой. Я попробую умозрительно описать некоторые будущие методы в главе 11.
