7.1. Выделение генов
Возможно использование нескольких путей выделения генов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.
Химический синтез генов, т. е. синтез нуклеотидов с заданной последовательностью, соответствующей одному гену, впервые был осуществлен в лаборатории Г. Кораны в 1969 г. (Agarwal К. [et al.], 1970). Это был ген аланиновой т-РНК дрожжей размером в 77 п. н. В то время это было выдающееся достижение науки. Еще более значительным событием стал искусственный синтез гена тирозиновой т-РНК, проведенный тем же исследователем в 1976 г. Этот ген включал области промотора и терминатора, а главное, он был биологически активен, т. е. работал при введении в клетку.
Уже в 1980-е гг. были успешно синтезированы функционально активные гены инсулина, соматостатина, интерферона. Прогресс в этой области позволил разработать специальные автоматы для синтеза ДНК определенной последовательности.
Получение отдельных генов из молекулы ДНК из природного генетического материала впервые осуществил Дж. Беквит в 1969 г. (Beckwith J., Zipser D., 1970), выделив гены лактозного оперона E. coli.
Главную роль в этом методе играют ферменты рестрикции (разрезания ДНК) – рестриктазы. Такие ферменты синтезируются практически всеми бактериями. Они относятся к группе ферментов-эндонуклеаз, которые делают разрезы в молекуле ДНК. Разные рестриктазы всегда разрезают ДНК в определенных местах – сайтах рестрикции, которые они способны узнавать. Собственная ДНК организма, продуцирующего рестриктазу, обычно модифицирована по участку узнавания, чтобы предотвратить саморасщепление. Модификация осуществляется посредством включения в ДНК бактерии модифицированных азотистых оснований особой ферментативной системой модификации. Ферменты рестрикции и модификации представляют собой единую систему. Эта система является своеобразным барьером, предохраняющим клетку от проникновения чужеродного генетического материала и включения его в собственный геном. Структура многих сайтов рестрикции-модификации в настоящее время расшифрована.
Ферменты бактериальной клетки могут модифицировать ДНК внедрившегося фага еще до того, как его атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приведет к лизису клетки, а все потомство такого фага будет содержать также модифицированную ДНК. Оно будет способно заражать другие бактерии с такой же системой репарации.
К 1977 г. А. Максамом, У. Гилбертом и Ф. Сэнджером (Gilbert W., 1981; Sanger F., 1981) были разработаны специальные методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК, которые получили название секвенирование (от англ. sequence – последовательность). Эти методы сыграли судьбоносную роль в становлении геномики и генной инженерии. Методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы. Разработаны разные методические подходы секвенирования и способы выделения набора фрагментов. В настоящее время высокий уровень технического оснащения сделал секвенирование достаточно рутинной лабораторной работой.
Синтез генов путем обратной транскрипции первоначально представлялся наиболее перспективным. Если известна хотя бы часть первичной структуры нужного белка, то можно синтезировать коллинеарную часть соответствующего гена. Такие участки получили название ДНК-зондов. Их применяют для поиска м-РНК, имеющей комплементарный им участок. Выделенную с помощью зонда м-РНК можно использовать для синтеза комплементарной ДНК (к-ДНК) путем обратной транскрипции. После синтеза одной цепи с помощью ДНК-полимеразы можно синтезировать вторую цепь.
Большим недостатком этого метода является отсутствие регуляторных элементов в синтезированных генах, необходимых для экспрессии. К тому же часто к-ДНК является упрощенной копией гена, поскольку содержит только его кодирующую часть, т. е. экзоны (без интронов).
