7.3. Введение рекомбинантной ДНК в клетку

К настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов.

Плазмиды являются основным материалом векторов. Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.

На первых этапах генной инженерии применяли естественные плазмиды бактерий. Сейчас создают искусственные (рекомбинантные) плазмиды со стандартными свойствами. Они обычно содержат один сайт рестрикции к какой-либо одной рестриктазе, несут два гена устойчивости к разным антибиотикам и имеют ослабленный контроль репликации. Контроль репликации, свойственный природным плазмидам, ограничивает число плазмид в клетке. Обычно бактериальная клетка имеет 20–30 плазмид, но ослабленный контроль репликации позволяет накапливать в клетке более 1000 плазмид.

Разрыв ДНК плазмиды в сайте рестрикции превращает ее в линейную молекулу. Если той же рестриктазой была разрезана и чужеродная ДНК для выделения нужного гена, то этот ген можно «сшить» с плазмидной ДНК по одинаковым «липким концам» (рис. 7.1).

7.3. Введение рекомбинантной ДНК в клетку

— AD —

Рис. 7.1. Плазмида-вектор с встроенной экзогенной ДНК

Полученная гибридная (или химерная) плазмида будет представлять собой рекомбинантную ДНК. Гибридная плазмида может существовать в бактериальной клетке долгое время. Она реплицируется так же, как и исходная плазмида. Обычно встроенная чужеродная ДНК не влияет на свойства бактерий.

Единственные известные в природе эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. В генной инженерии были «сконструированы» особые плазмиды, способные существовать в клетках как бактерии E. coli, так и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этом случае один и тот же вектор может быть использован с двумя хозяевами.

Явление переноса генетической информации при помощи вирусов называется трансдукцией и встречается в живой природе.

В генной инженерии наиболее широко применяется фаг ?. ДНК фага представляет собой линейную молекулу, поэтому один разрыв рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов. Эти фрагменты сшивают с чужеродной ДНК, в результате чего образуется химерный фаг. Этот фаг должен пройти цикл литической инфекции для накопления достаточного количества встроенной ДНК.

Размер встраиваемой ДНК не должен превышать 10 % генома фага, иначе он не поместится в капсид. Для решения этой проблемыу фага-вектора удаляют часть собственной ДНК, оставляя только необходимые гены.

В последнее время разработаны тонкие методы введения экзогенной ДНК в клетки-реципиенты при помощи микроинъекций.

Экспрессия чужеродного генетического материала в клетке-реципиенте представлялась наиболее трудной задачей на заре становления генной инженерии.

Накопление необходимого количества ДНК, при использовании как вирусных, так и плазмидных векторов происходит в бактериальной клетке-хозяине. Обычно эукариотические гены в бактериальной клетке не экспрессируются. Для преодоления этого барьера разработаны различные подходы.

В последние годы большое значение приобрел новый метод – полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющий размножить любой интересующий исследователя фрагмент ДНК. Для этого используются специфические праймеры (затравки) длиной 18–20 нуклеотидов и термостойкие ДНК-полимеразы. ПЦР позволяет увеличить количество ДНК любого участка в сотни раз.

Для транскрипции эукариотического гена в бактериальной клетке он должен быть помещен под контроль бактериального промотора. Это достигается встраиванием либо кодирующей последовательности эукариотического гена в структуру оперона (причем рядом с промотором), либо бактериального промотора в вектор.

Для трансляции синтезированной чужеродной м-РНК были сконструированы векторы, в которых сайт рестрикции находится рядом с участком связывания рибосомы (за промотором), а вставка начинается со стартового кодона.

При трансформации эукариот посредством ДНК бактерий необходимо учитывать, что репликаторы бактериальной клетки в эукариотической клетке не работают. Для преодоления этого барьера введенная ДНК должна быть интегрирована с хромосомой, что значительно легче осуществить у микроорганизмов. Хорошую модель такого процесса мы можем наблюдать в природе. Было показано, что причиной опухолей некоторых растений является бактериальная Ti-плазмида длиной около 200 000 п. н. Эти плазмиды проникают в клетки растений, часть ДНК Ti-плазмиды (Т-ДНК) встраивается в хромосомы растений и вызывает образование опухолей, нарушая баланс фитогормонов. С помощью Ti-плазмиды были проведены различные эксперименты на растениях (Инге-Вечтомов С. Г., 1989).

В настоящее время многие барьеры, препятствующие первым исследованиям, преодолены. В бактериальном геноме экспрессируются введенные гены человека (инсулина, интерферона, гормона роста и др.). Успешно вводятся чужие гены, в том числе и человека, в геномы животных. Чужеродный ген, введенный в клетку какого-либо организма, получил название трансгена. Животных, носителей такого гена, называют трансгенными. Генная инженерия породила целую новую индустрию – биотехнологию.

Похожие книги из библиотеки

Как стать другом своему ребенку. Папа, папочка, папуля

Эта книга написана для всех пап, которые хотят быть лучшими отцами для своих детей. Это под силу каждому мужчине: • стать для своего ребенка надежным и сильным другом, к которому можно обратиться в любой ситуации; • построить доверительные и крепкие отношения с детьми, дружить и весело проводить с ними время; • быть для них опорой в жизни и лучшим примером для подражания. На личном примере автор показывает, что заботиться о своем ребенке, думать о его потребностях, принимать активное участие в его ежедневных делах наравне с мамой – это , , . нормально правильно важно и полезно Папы узнают, как подготовиться к зачатию и осознать себя в роли отца; как поддержать жену во время беременности и родов, преодолеть трудности и напряжение в период младенчества; как взрастить в ребенке уникальную личность, принять его таким, какой он есть, и построить отношения в семье, основанные на уважении и взаимном доверии. Особое внимание автор уделяет организации личного пространства папы: где и как черпать терпение, вдохновение, спокойствие и гармонию. Книга в первую очередь адресована папам – будущим и состоявшимся, а также мамам, бабушкам и дедушкам, психологам и педагогам по работе с детьми.

50 головоломок для тренировки и развития памяти

Вы периодически расстраиваетесь из-за того, что не можете вспомнить имени человека, с которым познакомились буквально вчера? Книга «50 головоломок для тренировки и развития памяти» содержит в себе задачи и упражнения, благодаря которым вы легко освоите самые прогрессивные техники запоминания. Ее автор Чарльз Филлипс – один из лучших специалистов по изучению методик развития мозга и интеллекта, который написал более 30 бестселлеров, переведенных на десятки языков мира.

Сверходаренный – поэтому несчастный :( Как использовать свой потенциал

Вы чувствуете себя слишком ранимым, вас легко обидеть? Вам кажется, что друзья и родные вас не понимают, а может даже считают «странным»? Вам сложно выстроить отношения, и вы часто впадаете в депрессию? У вас масса идей, но вы не можете их реализовать? Работать вам скучно, потому что вы не можете реализовать весь свой потенциал? Вас ждет открытие: вы – сверходаренный человек! В своей книге практикующий психолог, автор бестселлеров, которыми зачитывается Франция, Жанна Сио-Фашен утверждает, что большинство ваших проблем – это результат вашей сверходаренности! Никто никогда не говорил вам об этом, и вы не знаете, как использовать свой высокий потенциал. Вы страдаете, а ведь могли бы добиться невероятного успеха! Эта книга научит вас управлять своей сверходаренностью. Читайте, и вы поймете, как избавиться от боли и страданий и полностью реализовать таланты, которыми наградила вас природа. Книга будет полезна всем сверходаренным людям от 3 до 99 лет! А также их родителям, учителям и друзьям.

Медицинские советы. Для вас и вашего здоровья

Книга известного врача-невролога и мануального терапевта Александра Николаевича Тутова состоит из трех частей. В первой – советы и рекомендации по различным неврологическим заболеваниям, во второй – ответы на актуальные вопросы, в третьей затрагиваются проблемы нашего здравоохранения. А.Н. Тутов является автором методики лечения заболеваний шеи и «Практического массажа». Этими методами на ноги поставлены тысячи больных.