Микробиология газовой гангрены

На жидких средах C. perfringens быстро растет, вызывая помутнение и энергичную ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа; ферментирует также лактозу, мальтозу и сахарозу, но не ферментирует маннит; молоко створаживает через 3 – 5 ч с образованием рыхлого сгустка и с отделением прозрачной сыворотки; разжижает желатин; на кровяном агаре образует колонии диаметром 2 – 5 мм с зоной гемолиза и приподнятым центром. В столбике агара образуются дисковидные колонии.

C. perfringens обладает высокой инвазивностью и сильной токсигенностью. Первая связана со способностью возбудителя вырабатывать гиалуронидазу и другие ферменты, которые оказывают также и разрушающее действие на клетки соединительной ткани и мышцы. Главным фактором патогенности C. perfringens является вырабатываемый им сложного состава экзотоксин. Гемотоксическое, некротоксическое, нейротоксическое, лейкотоксическое и летальное действия связаны с различными компонентами экзотоксина. Отдельные штаммы C. perfringens синтезируют экзотоксины разного состава и разной антигенной специфичности, в соответствии с которой различают 6 серологических типов этого возбудителя: A, B, C, D, E, F.

Серотип А – один из главных возбудителей газовой гангрены у людей. Его токсин содержит не менее 6 компонентов: альфа, эта, тэта, каппа, мю, ню (?, ?, ?, ?, ?, ?), главным из которых является альфа-лецитиназа С. Способность других серотипов C. perfringens вызывать газовую гангрену зависит также во многом от продукции ими различных компонентов экзотоксина, в том числе альфа-, бета-, тэта-, эпсилон– и др.

При заражении животных C. perfringens наблюдается обширное отслоение кожных покровов, распад мышечной ткани, кровянистый экссудат, пузырьки газа в подкожной клетчатке; мышцы дряблые, серого цвета, имеют вид вареного мяса. Некоторые серотипы C. perfringens (A, C, D, F) являются виновниками пищевых токсикоинфекций и тяжелых энтеритов, в патогенезе которых установлена ведущая роль некротоксинов и энтеротоксинов. Они продуцируются наиболее активно во время споруляции клостридий. C. perfringens типа D вырабатывает энтеротоксин в виде неактивного протоксина, активацию которого осуществляет протеаза.

Clostridium novyi открыт в 1894 г. Ф. Нови. Грамположительная полиморфная толстая палочка с закругленными концами, диаметром 0,8 – 1,4 мкм и длиной 1,6 – 2,5 мкм, нередко располагается в виде цепочек из 2 – 5 клеток. Капсулы не образует, подвижный перитрих (серотип С неподвижен). Споры овальные или круглые, располагаются субтерминально, редко – центрально. Наиболее строгий анаэроб, на жидких средах растет в виде легкого помутнения, дает большой осадок, наблюдается умеренная ферментация глюкозы с образованием газа. Молоко свертывает медленно, желатин разжижает. На кровяном агаре она образует серые бугристые колонии с приподнятым центром, отходящими отростками и зоной гемолиза;

в столбике с агаром дает хлопьевидные колонии; ферментирует глюкозу, мальтозу, не ферментирует лактозу. Патогенность C. novyi обусловлена его способностью продуцировать очень сильный экзотоксин сложного состава, вызывающий при заражении животных характерный бесцветный или розового цвета отек желеобразной консистенции. Токсин обладает также гемолитическим и летальным свойствами. Различают 3 основных типа C. novyi – A, B и C. Тип А продуцирует альфа-, гамма-, дельта-, эпсилон-экзотоксины, с которыми связана его способность вызывать заболевание у людей. Оптимальная температура для роста 40 – 45 °C. Содержание Г + Ц в ДНК – 23 мол %. Тип В продуцирует альфа-, бета-, дзэта– и эта-токсины. Оптимальная температура для роста C. novyi 37 °C, растет в диапазоне 25 – 45 °C. Он вызывает газовую гангрену у людей и заболевания животных. Тип С продуцирует небольшое количество гамма-токсина. Температурный оптимум для роста 45 °C. Выделен при остеомиелите у буйволов.

Clostridium septicum выделен в 1877 г. Л. Пастером и Ж. Жубером из трупа коровы. Вызванные возбудителем изменения Л. Пастер рассматривал как септицемию, в связи с чем он и был назван вначале Vibrio septique. C. septicum – тонкая длинная полиморфная палочка диаметром 1,1 – 1,6 мкм, длиной 3,1 – 14,1 мкм, нередко образует нити длиной до 50 мкм, грамположительна, перитрих, капсулы не образует. Споры овальные, располагаются субтерминально или центрально, образуются быстро, уже через 24 ч. На жидкой среде вызывает помутнение, молоко свертывает медленно, гидролизует желатин, ферментирует глюкозу, лактозу, мальтозу с образованием кислоты и газа, не ферментирует маннит и сахарозу. На кровяном агаре колонии окружены зоной гемолиза и имеют тонкие многочисленные отростки; в столбике агара колонии имеют вид пушинок с уплотненным центром.

C. septicum патогенна для человека и домашних животных. Продуцируемый экзотоксин обладает некротическим, гемолитическим и летальным действием. При заражении животных вызывает кровянисто-серозный отек, мышцы имеют темнокрасный цвет, в подкожной клетчатке и в мышцах – пузырьки газа.

Clostridium histolyticum открыт в 1916 г. М. Вейнбергом и Е. Сегеном. Прямая палочка длиной 1,6 – 3,1 мкм, диаметром 0,6 – 1,0 мкм, подвижна (перитрих), капсул не образует, споры овальные, располагаются субтерминально, углеводы не ферментирует. Молоко быстро пептонизирует. На жидких средах дает общее помутнение.

Колонии в столбике агара компактные, мохнатые, неправильной формы. На кровяном агаре колонии мелкие, прозрачные, как капельки росы, с узкой зоной гемолиза. C. histolyticum обладает сильными протеолитическими ферментами, быстро разжижает желатин; при заражении животных происходит протеолиз мягких тканей с обнажением костей и отпаданием конечностей. Продуцируемый экзотоксин при внутривенном введении животным вызывает быструю смерть. C. histolyticum в природе распространен сравнительно мало, встречается в почве, в сточных водах, иногда в кишечнике человека.

Clostridium sordellii обнаружен в 1922 г. Р. Сорделли. Прямая грамположительная толстая палочка диаметром 1,1 – 1,6 мкм, длиной 3,1 – 4,5 мкм, иногда образует цепочки из 3 – 4 клеток, подвижна (перитрих), капсулы не образует, споры овальные, располагаются субтерминально или центрально; обладает сильными протеолитическими свойствами, быстро разжижает желатин; ферментирует глюкозу, левулезу, мальтозу с образованием кислоты и газа, медленно свертывает молоко. Температурный оптимум для роста 37 °C. Содержание Г + Ц в ДНК – 26 мол %.

Clostridium sporogenes открыт в 1908 г. И. И. Мечниковым. Прямая палочка диаметром 0,3 – 0,4 мкм и длиной 1,4 – 6,6 мкм, грамположительна, подвижна (перитрих), капсулы не образует, споры овальные, располагаются субтерминально. Рост на жидкой среде с глюкозой сопровождается помутнением и энергичным газообразованием. На плотных средах колонии диаметром 2 – 6 мм имеют характерную форму, напоминающую голову Медузы, полупрозрачные, с матовой поверхностью. Оптимальная температура для роста 30 – 40 °C, диапазон роста 25 – 45 °C. Содержание Г + Ц в ДНК – 26 мол %. C. sporogenes обладает сильными протеолитическими свойствами, вызывает в ранах протеолиз мертвых тканей, обусловливая гнилостный запах.

Clostridium difficile впервые был описан в 1935 г. И. Холлом и Е. О’Тулом как представитель нормальной микрофлоры кишечника. Он обнаруживается у 3 % здоровых людей. Позднее был выделен из огнестрельных ран, при газовой гангрене, из различных абсцессов, плевральной жидкости, при неспецифических уретритах. Кроме того, установлена его этиологическая роль при антибиотико-ассоциированных псевдомембранозных колитах. С. difficile – палочка длиной 3,1 – 6,4 мкм, диаметром 1,3 – 1,6 мкм, грамположительна, подвижна (перитрих), капсулы не образует, споры овальные, располагаются субтерминально. Оптимальная для роста температура 30 – 37 °C (диапазон роста 25 – 45 °C). Содержание Г + Ц в ДНК – 28 мол %. Колонии на плотных средах круглые, диаметром 3 – 5 мм, с ровными краями, слегка выпуклые, серовато-белого цвета с матовой поверхностью. На питательном бульоне C. difficile дает умеренный рост с ферментацией или без ферментации глюкозы, на дне зернистый осадок; молоко не створаживает; на кровяном агаре большинство штаммов не дает гемолиза.

Основным фактором патогенности Clostridium difficile служит токсический комплекс, состоящий как минимум из двух токсинов: энтеротоксина (A) и цитотоксина (B). Комплекс в различных биологических тест-системах показывает диареегенную, цитотоксическую и летальную активность. Clostridium difficile является возбудителем псевдомембранозного колита в 90 – 100 % случаев. Для диагностики этого заболевания прибегают как к выделению возбудителя из испражнений, так и к обнаружению токсина. Токсин обнаруживают по его цитопатическому действию (ЦД), проявляемому на различных культурах клеток. Его специфичность устанавливают по реакции нейтрализации ЦД антитоксической сывороткой. Для обнаружения и идентификации токсина (токсинов) может быть использована ПЦР.

Особенности патогенеза газовой гангрены. Газовая гангрена – это своеобразный патологический процесс, который дает различные клинические проявления в зависимости от места локализации. Различают следующие формы этой болезни: анаэробная инфекция мягких тканей конечностей и туловища; анаэробная инфекция мозга; послеродовая или послеабортная анаэробная инфекция; анаэробная инфекция органов брюшной полости и брюшины; анаэробная инфекция органов грудной полости и анаэробный остеомиелит. Все они характеризуются единством патогенеза. Анаэробная инфекция в отличие от гнойных заболеваний, вызываемых аэробными бактериями, протекает без ярко выраженного воспаления. Для нее характерны: прогрессирующий некроз тканей, отек, газообразование в тканях и отравление организма токсинами возбудителя и продуктами распада тканей. Газовая гангрена встречается как в мирное, так и, в особенности, в военное время. Во время Великой Отечественной войны 1941 – 1945 гг. она наблюдалась у 1 – 14 % раненых. В военное время чаще всего наблюдается газовая гангрена мягких тканей конечностей, особенно нижних. Надо иметь в виду, что патогенные анаэробы очень часто обнаруживаются в ранах, но для развития анаэробной инфекции необходимы определенные условия. Клостридии – некропаразиты, благоприятной средой для их размножения служат мертвые или поврежденные ткани. Поэтому наиболее опасны тяжелые повреждения с обширной раневой поверхностью, нарушением кровообращения, гематомами, размозжением мышц, раздроблением костей, образованием слепых ходов и т. п. Попадая в такие раны, клостридии начинают быстро размножаться в глубине поврежденной ткани (анаэробные условия) и выделять экзотоксины. Обладая высокой инвазивностью, они проникают и в здоровую ткань, вначале повреждая ее, а затем и некротизируя своими токсинами и ферментами. Особенно бурно процесс протекает в мышечной ткани, содержащей гликоген и являющейся хорошей питательной средой для клостридий. В патогенном действии клостридий и их токсинов различают две стадии:

1. Образование отека. Вследствие действия токсина повышается проницаемость кровеносных сосудов для плазмы и клеток крови. Развитие отека приводит к сдавливанию ткани; кроме того, с отечной жидкостью поступает токсин. Все это приводит к повреждению тканей и делает их доступными для размножения клостридий.

2. Развитие газовой гангрены, т. е. некроз мышечной и соединительной тканей. Газообразование является результатом ферментативной активности клостридий, а некроз – следствием некротоксического действия токсинов и ферментов. Токсины не только действуют местно, но и вызывают сильнейшую общую интоксикацию (нейротоксическое действие). К специфической бактериальной интоксикации присоединяется отравление продуктами тканевого разложения. Чем больше зона поражения, тем сильнее и разнообразнее интоксикация организма. Таким образом, клиника газовой гангрены определяется общим и местным действием токсинов и ферментов клостридий, а также отравлением продуктами тканевого распада.

Инкубационный период длится от нескольких часов до 5 дней, иногда дольше. В зависимости от свойств и ассоциации клостридий, вызвавших анаэробную инфекцию, клиника ее может быть разной: эмфизематозная, токсическая (отечная), смешанная и т. п. Анаэробная инфекция продолжается 5 – 6 дней, и эти дни решают исход заболевания. Летальность во время первой мировой войны достигала 60 %.

Постинфекционный и поствакцинальный иммунитет в основном опосредуется антитоксинами. Роль антимикробных антител второстепенна. Продолжительность и напряженность иммунитета после перенесенной инфекции изучены недостаточно.

Лабораторная диагностика. Материалом для исследования служат кусочки пораженных тканей (некротизированная и пограничные с ней участки) и отечная жидкость. Кроме того, исследованию в случае необходимости подвергают перевязочный и шовный материал (шелк, кетгут), одежду, образцы почвы; при пищевых интоксикациях, вызванных клостридиями, – испражнения и продукты. Микробиологическая диагностика заключается в выделении из исследуемого материала возбудителя и его идентификации, основанной на изучении морфологических, культуральных, биохимических свойств и определении токсигенности. Исследование состоит из нескольких этапов:

1) бактериоскопия отделяемого раны или экссудата;

2) выделение возбудителя и его идентификация;

3) заражение белых мышей исследуемым материалом, фильтратом бульонной культуры или кровью больных для обнаружения токсина;

4) идентификация токсина клостридий с помощью реакций нейтрализации специфическими антитоксическими сыворотками в биологических пробах на белых мышах или культурах клеток (C. difficile).

Для выделения клостридий используют следующие среды: А. Жидкие накопительные (казеиновые или мясные, содержащие 1 % глюкозы и кусочки печени, перед посевом кипятят и заливают вазелиновым маслом для создания анаэробных условий), молоко. Б. Плотные – кровяной агар Цейсслера (15 % дефибринированной крови + 2 % глюкозы); кровяной агар с бензидином (колонии C. novyi на такой среде чернеют на воздухе); cреда Вильсона – Блера в длинных стеклянных трубочках (C. perfringens в такой среде уже через 3 – 4 ч вызывает почернение в месте своего размножения за счет образования сернистого железа из Na₂S и FeCl₃ и бурное газообразование за счет ферментации глюкозы); среда Виллиса – Хоббса (содержит, кроме питательного агара, лактозу, индикатор, яичный желток и обезжиренное молоко). На этой среде колонии C. perfringens окрашены в цвет индикатора (ферментируют лактозу), имеют ореол опалесценции (наличие лецитиназы); колонии C. novyi бесцветные (не ферментируют лактозу), окружены зоной опалесценции (лецитиназа); колонии C. septicum окрашены в красный цвет (ферментируют лактозу), но не имеют зоны опалесценции; колонии C. histolyticum – бесцветны, окружены зоной просветления; колонии C. sordellii, C. sporogenes и C. difficile – бесцветные (не ферментируют лактозу), но колонии C. sordellii имеют ореол опалесценции (имеют лецитиназу).

Материал для исследования делят на две части. Одну часть засевают на плотные дифференциально-диагностические (Виллиса – Хоббса и др.) и жидкие среды без прогревания, а другую – после прогревания при 80 °C 15 мин и при 100 °C (5 мин, 10 мин, 20 мин) засевают в жидкие мясные или казеиновые среды и инкубируют при 37 °C от 16 ч до 15 сут. (для прогретых проб). Выросшие культуры, содержащие массу грамположительных палочек, пересевают на плотные дифференциально-диагностические среды (Виллиса – Хоббса, Вильсона – Блера и др.) для получения изолированных колоний, а затем чистых культур и их идентификации.

При посеве исходного материала на дифференциально-диагностические среды после инкубации при 37 °C в течение 1 – 7 сут. колонии, вызвавшие соответствующие изменения на одной из этих сред и состоящие из грамположительных палочек, пересевают на мясные или казеиновые среды для дальнейшей идентификации. Для ускоренной диагностики газовой гангрены О. А. Комковой предложен следующий метод: посев производится в столбик полужидкого агара, к которому добавляется антитоксическая сыворотка. В такой среде с гомологичной антитоксической сывороткой клостридии вместо диффузного помутнения образуют изолированные колонии, а в препаратах-мазках из них имеют вид стрептобацилл (располагаются цепочками).

Лечение и профилактика. Главный метод предупреждения газовой гангрены – своевременная и правильная хирургическая обработка ран. В случае особо тяжелых ранений, которые могут повлечь развитие газовой гангрены, больному с профилактической целью вводят по 10 000 МЕ антитоксических сывороток против наиболее частых возбудителей – C. perfringens, C. novyi и C. septicum. С лечебной целью вводят те же сыворотки по 50 000 МЕ. При отсутствии эффекта сыворотки вводят повторно. Серотерапия должна обязательно сочетаться с эффективной антибиотикотерапией и соответствующим общеукрепляющим лечением.

Специфическая профилактика. Для создания искусственного иммунитета против анаэробной инфекции созданы препараты из различных анатоксинов, однако широкого применения они не получили.