Микрофлора полости рта
Благодаря постоянному наличию питательных веществ и оптимальным для размножения многих микроорганизмов температуре (37 °C) и рН (слабощелочная, около 6,9 – 7,0) полость рта является средой, исключительно благоприятной для существования и размножения самых различных видов микроорганизмов. В больших количествах они постоянно обнаруживаются на слизистой оболочке щек, десен, языка, в десневых карманах и на зубах. В слюне количество их может достигать 108 клеток на 1 мл, что соответствует количеству хорошо размножающихся бактерий в 1 мл МПБ. Эти микроорганизмы в известной мере представляют смешанную флору из различных областей полости рта, однако большинство из них присутствует на поверхности зубов. Накапливаясь на зубах, они образуют так называемые бактериальные, или зубные, бляшки. Содержание бактерий в них достигает 1011 клеток на 1 г сухого веса, что соответствует количеству бактерий в колонии, выросшей на плотной среде.
Микрофлора полости рта подразделяется на постоянную и случайную. Постоянная, нормальная, специфическая микрофлора сформировалась благодаря определенным, эволюционно выработанным отношениям симбиоза и антагонизма между различными видами микроорганизмов, с одной стороны, и между ними и защитными механизмами макроорганизма, с другой.
Постоянная, нормальная микрофлора ротовой полости представлена в основном комменсалами. Она, несомненно, выполняет ряд важных для организма функций: стимулирует развитие лимфоидной ткани и играет важную защитную роль. Представители нормальной микрофлоры, благодаря антагонистическому воздействию на представителей различных патогенных видов бактерий, попадающих в полость рта, подавляют их размножение. Нормальная микрофлора во многом обеспечивает самоочищение ротовой полости. Как и другие представители нормальной микрофлоры кишечного тракта, микроорганизмы полости рта способствуют снабжению организма ценными аминокислотами и витаминами, которые секретируются ими в процессе метаболизма. Наконец, продукты жизнедеятельности этих микроорганизмов могут стимулировать секрецию слюнных и слизистых желез, выделение слюны, необходимой для постоянного обмывания слизистой полости рта и осуществления актов приема пищи, жевания и глотания.
Микрофлора полости рта представляет собой сложнейшую форму биоценоза, в котором постоянно сосуществуют аэробы, факультативные и облигатные анаэробы, представленные многочисленными и разнообразными видами грамположительных и грамотрицательных бактерий. Исторически между ними в соответствии с имеющимися в полости рта условиями сложились определенные сбалансированные взаимоотношения. Нарушение этого баланса, например в результате нерационального применения антибиотиков, – частая причина дисбактериоза оральной микрофлоры. В этих случаях возникают «лекарственные» поражения слизистой оболочки (стоматиты, глосситы, ангины и т. п.). Их возбудителями чаще всего оказываются грибы рода Candida, энтерококки, различные грамотрицательные палочки (протей, кишечная палочка и др.).
Наиболее значительную часть нормальной оральной микрофлоры в различных областях полости рта представляют ?-, ?– и ?-стрептококки: факультативно-анаэробные (в том числе S. salivarius, S. mitis, кариесогенные и др.) и облигатные анаэробы (Peptostreptococcus), а также грамположительные нитевидные микроорганизмы (Actinomyces). В составе микрофлоры полости рта обнаруживаются такие организмы, как лактобациллы и грамнегативные кокки, относящиеся к родам Neisseria и Veillonella, а также грамотрицательные бактерии, строгие анаэробы из семейства Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia). К постоянной микрофлоре полости рта следует отнести различные виды спирохет (Treponema denticola, T. orale, T. macrodentium, Borrelia buccalis), микоплазмы (M. salivarium, M. orale), нокардии, а также другие такие микроорганизмы, которые пока не удается культивировать, так как условия их роста слабо изучены.
К случайной микрофлоре полости рта относятся комменсалы, обитающие на других слизистых оболочках и коже, сапрофиты внешней среды и различные патогенные микроорганизмы, которые попадают в полость рта в результате аэрогенного или алиментарного заражения от больных или бактерионосителей. Очень высокой способностью адаптироваться к существованию в ротовой полости обладают стафилококки, стрептококки серологических групп A, C, D, F, G; коринебактерии; грибы кандида; вирусы герпеса, эпидемического паротита и др. В связи со сложным видовым составом оральной микрофлоры не всегда легко определить, какой (какие) специфический патоген является возбудителем того или иного патологического процесса в полости рта человека. Определенные виды возбудителей или их группы могут оказывать существенное влияние своими метаболическими процессами на развитие болезни. Оральные бактерии обладают многими токсическими факторами, с помощью которых они опосредуют свое патогенное действие. Например, активность таких бактериальных ферментов, как гиалуронидаза, нейраминидаза, коллагеназа, муциназа, протеазы и т. п., может оказать существенное воздействие на формирование и развитие патологического очага. Другим примером веществ, способных оказывать пагубные действия на ткани организма, являются кислые метаболиты и конечные продукты, особенно органические кислоты, образующиеся при потреблении бактериями углеводов.
Болезни зубов протекают обычно в виде хронических инфекций. В табл. 56 представлены наиболее важные сведения о них и микроорганизмах, которые можно рассматривать в качестве их потенциальных возбудителей.
Таблица 56
Основные болезни зубов и микроорганизмы, потенциально участвующие в их развитии
В связи с тем, что свойства ряда этих микроорганизмов выше не были рассмотрены, ниже приводится характеристика наиболее важных представителей микрофлоры полости рта.
Peptostreptococcus. Этот род включает 5 видов: P. anaerobius, P. productus, P. lanceolatus, P. micros и P. parvulus. Пептострептококки имеют форму шаровидных или овальных клеток диаметром 0,7 – 1,0 мкм, иногда 0,3 – 0,5 мкм. Располагаются парами в виде коротких или длинных цепочек, жгутиков не имеют, спор не образуют, грамположительны, строгие анаэробы. Хемоорганотрофы. Сбраживают углеводы (за одним исключением) с образованием кислоты или газа либо того и другого. Некоторые виды образуют газ в пептонной воде без углеводов. При ферментации углеводов и пептона образуют следующие кислоты (по отдельности или в сочетаниях): уксусную, муравьиную, пропионовую, масляную, изомасляную, валериановую, капроновую, янтарную. Нитраты не восстанавливают, каталазы не имеют, индола обычно не образуют, желатин не разжижают. Редко обладают гемолитическими свойствами. Не образуют лецитиназы, липазы и ацетоина. Не сбраживают адонита, эритрита и гликогена. Выделены из нормальных и инфицированных женских половых путей, из дыхательных путей и кишечника здоровых людей и животных, из септических ран, при аппендиците, а также из ротовой полости при гноеродных инфекциях. Дифференциальные признаки, по которым различают виды этого рода, представлены в табл. 57.
Помимо пептострептококков, в полости рта обитают факультативные анаэробные оральные стрептококки. По своим общим биологическим свойствам оральные стрептококки соответствуют характеристике рода Streptococcus, к которому они относятся.
Основные свойства кариесогенных стрептококков приведены ниже. Дифференциальные признаки некоторых видов оральных стрептококков представлены в табл. 58.
Таблица 57
Дифференциальные признаки видов рода Peptostreptococcus
Примечание. (+) – признак положительный; ( – ) – признак отсутствует; (с) – наблюдается слабая положительная реакция.
Таблица 58
Дифференциальные признаки некоторых видов оральных стрептококков
Примечание.(+) – признак положительный; ( – ) – признак отсутствует; (±) – признак непостоянный, у одних штаммов положительный, у других – отсутствует.
Veillonella. К роду Veillonella (семейство Veillonellaceae) относятся мелкие (0,3 – 0,5 мкм в диаметре), грамотрицательные, неподвижные, не образующие спор анаэробные кокки. При светооптической микроскопии они выглядят в виде диплококков, скопления клеток или в виде коротких цепочек. При электронной микроскопии одиночные клетки имеют шаровидную форму, а диплококки уплощены в месте соединения клеток. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 40 – 44 мол %. Оптимальная температура для их роста 30 – 37 °C, ниже 18 °C и выше 45 °C не растут. Диапазон рН для роста 6,5 – 8,0. Хемоорганотрофы со сложными питательными потребностями. Углеводы и многоатомные спирты не ферментируют. Желатин не разжижают, индола не образуют, гемолитическими свойствами не обладают, восстанавливают нитраты в нитриты, образуют сероводород из серусодержащих аминокислот. Из лактата образуют ацетат, пропионат, СО2 и Н2. Для выделения культур используют агаровые среды, содержащие лактат и ванкомицин (7,5 мкг/мл), к которому вейллонеллы устойчивы в концентрации 500 мкг/мл. Колонии на плотной среде мелкие (1 – 3 мм), гладкие, чечевицеобразные, ромбовидные или сердцевидной формы, серовато-белые и маслянистые, непрозрачные.
Семейство Bacteroidaceae. В полости рта обитают представители главным образом следующих родов этого семейства: Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichia.
Bacteroides. Род включает более 45 видов. К нему относятся грамотрицательные, не образующие спор, подвижные (перитрихи) или неподвижные палочки, строгие анаэробы. Основное отличие бактероидов от рода фузобактерий состоит в том, что они образуют из глюкозы и пептона в качестве одного из главных продуктов масляную кислоту (без изомасляной и изовалериановой кислот). Бактероиды – хемоорганотрофы. В процессе метаболизма углеводов или пептона продуктами брожения, кроме масляной кислоты, являются также комбинации янтарной, молочной, уксусной, муравьиной и пропионовой кислот. Каталазу, лецитиназу и липаз обычно не образуют. Гиппурат не гидролизуют. Оптимальная температура для роста 37 °C, рН 7,0. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 40 – 55 мол%.
Для дифференциации на виды учитывают комплекс признаков, в том числе образование черного пигмента на агаре с лаковой кровью или желатином, степень сбраживания углеводов, рост в 20 % желчи, образование индола, потребность в гемине, образование кислот при ферментации ряда углеводов, форма клеток, подвижность, образование газа, восстановление нитратов в нитриты, гидролиз желатина, эскулина и др.
Отличительные признаки Bacteroides melaninоgenicus: образуют черный пигмент на агаре с лаковой кровью. Колонии на такой среде через 2 – 3 дня инкубации серые или коричневые, или черные, диаметром 0,5 – 3,0 мм, чернеют при более продолжительной инкубации (5 – 14 дней). На бульоне с глюкозой при росте образуют диффузное помутнение и осадок. Большинство штаммов для роста нуждается в гемине (1 мкг/мл) или в менадионе (0,1 мкг/мл), или в обоих. Растут при температуре 25 °C и рН 8,5; некоторые штаммы растут при 45 °C. Выделены из слюны, мочи, испражнений, а также при инфекционных заболеваниях полости рта, мягких тканей, дыхательных путей, кишечного и урогенитального трактов.
По степени ферментативной активности B. melaninogenicus подразделяют на три подвида: сильно ферментирующие, слабо ферментирующие и неферментирующие. Подвиды различаются по сахаролитической, протеолитической активности и по образованию кислоты из глюкозы.
1. Сильно сахаролитический, непротеолитический B. melaninogenicus subsp. melaninogenicus – из глюкозы образует кислоту, протеолитическими свойствами не обладает.
2. Умеренно сахаролитический, умеренно протеолитический B. melaninogenicus subsp. intermedius.
3. Не ферментирующий глюкозы B. melaninogenicus subsp. asaccharolyticus.
Отличительные признаки B. oralis: черного пигмента не образует; углеводы сбраживает интенсивно, один из главных продуктов сбраживания – янтарная кислота. Гемин для роста не требуется. Из арабинозы кислоты не образует. Длинных и тонких клеток не образует. Колонии на плотной среде через два дня круглые, гладкие, выпуклые, полупрозрачные, диаметром 0,5 – 2,0 мм. Гемолитическими свойствами, как правило, не обладает. На сахарном бульоне рост сопровождается помутнением, без осадка или с образованием осадка. Декарбоксилаз лизина, орнитина, аргинина и глутаминовой кислоты, а также уреазы и сероводорода не образует. Выделены из десневых карманов у людей и при инфекциях полости рта, верхних дыхательных и половых путей.
Fusobacterium включает 16 видов. К роду относятся грамотрицательные, не образующие спор бактерии, неподвижные или подвижные (перитрихи). Хемоорганотрофы. Ферментируют ряд углеводов. Продуктами сбраживания углеводов или пептона являются молочная, уксусная, масляная кислоты, меньше образуется пропионовой, янтарной и муравьиной кислот. Пируват превращают в ацетат и бутират.
Каталазу обычно не образуют. Строгие анаэробы. Оптимальная температура для роста – 37 °C, рН 7,0. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 26 – 34 мол %. Виды дифференцируют по следующим признакам: образование индола, пропионата из лактата или треонина; гидролиз эскулина; образование кислоты из лактозы, маннозы, мальтозы, маннита, сахарозы; образование газа в глубине глюкозного агара; форма клеток; восстановление нитратов, подвижность.
К виду F. plauti относятся подвижные (перитрихи) палочки длиной около 10 мкм, не образующие индола; не образующие (или почти не образующие) газа в глубине глюкозного агара; не восстанавливающие нитраты и не гидролизующие эскулин.
Leptotrichia. Лептотрихии имеют вид прямых или слегка изогнутых грамотрицательных палочек диаметром 1,0 – 1,5 мкм и длиной 5,0 – 15,0 мкм, с одним или двумя закругленными или, чаще, заостренными концами. Две или больше клеток объединяются в септированные, различной длины нити, которые в старых культурах достигают длины 200 мкм и чаще переплетаются друг с другом. При лизисе клеток в нитях появляются круглые шаровидные или луковицеобразные вздутия. Ветвящихся и булавовидных клеток не образуют. Неподвижны. Строгие анаэробы. Гетеротрофы со сложными питательными потребностями. Глюкозу ферментируют с образованием кислоты без газа. Главные продукты брожения – молочная и уксусная кислоты, масляной кислоты не образуют. Реакция Фогеса – Проскауэра отрицательная. Желатин не разжижают, нитраты обычно не восстанавливают. Индола, H2S и каталазы не образуют. Оптимальная температура для роста 37 °C, ниже 25 °C и выше 45 °C не растут; оптимальная рН 7,2 – 7,4. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 32 – 34 мол %. Место обитания – ротовая полость человека.
Leptotrichia buccalis – типовой вид рода. Отличительные признаки: в столбике агара образуют дольчатые, свернутые, извилистые колонии, которые напоминают голову Медузы; на среде, содержащей кристаллический фиолетовый, колонии имеют радужный вид. Поверхность колоний по консистенции варьирует от маслянистой до хрупкой. L. buccalis лучше растет в атмосфере, содержащей 5 % СО2, и на средах с добавлением сыворотки, асцитической жидкости или крахмала. Рост в глубине агарового столбика начинается обычно на 1 см ниже его поверхности. Роста не происходит в отсутствие 2 % NaCl. Хорошо растет в среде, содержащей 0,001 % кристаллического фиолетового или 10 мкг/мл стрептомицина. Ферментирует глюкозу, фруктозу, мальтозу, маннозу и сахарозу с образованием кислоты без газа. Обычно ферментирует также салицин, трегалозу, галактозу, лактозу, рафинозу и крахмал. Не образует кислоты из арабинозы, дульцита, инулина, глицерина, маннита, рамнозы, сорбита и ксилозы; не ферментирует лактаты.
Род Lactobacillus включает в себя не менее 25 видов. Бактерии имеют вид палочек от длинных и тонких до коротких типа коккобактерий. Нередко образуют цепочки, особенно в поздней стадии log-фазы. Как правило, неподвижные, редко встречаются подвижные (перитрихи). Спор не образуют, в молодых культурах грамположительны; в старых культурах и при повышенной кислотности становятся грамотрицательными. У некоторых штаммов обнаруживаются зернистость, биполярные включения или полосатость при окраске по Граму или метиленовым синим. Метаболизм бродильный, но могут расти и на воздухе; некоторые – строгие анаэробы. Одно из важнейших свойств – способность ферментировать сахара с образованием молочной кислоты, но лактата не сбраживают. Дополнительные продукты брожения – уксусная и янтарная кислоты, СО2 и этанол. Желатин не разжижают, индола и сероводорода не образуют, каталазо– и цитохромотрицательны. Нитраты восстанавливают редко и только при рН выше 6,0. Редко образуют пигмент от желтого или оранжевого до ржавого или кирпично-красного цвета. Обладают сложными питательными потребностями, специфическими для каждого вида. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 35 – 54 мол %. Температурные границы роста от 5° до 53 °C, оптимальная температура обычно 30 – 40 °C. Кислотолюбивы – оптимальная рН 5,5 – 5,8. Обычно растут при рН 5,0 и ниже. Встречаются в различных молочных продуктах, в воде, сточных водах, пиве, вине, на фруктах и в фруктовых соках, в солениях, маринадах, закваске для теста. Являются обитателями ротовой полости, кишечного тракта и влагалища многих теплокровных животных и человека.
Отличительные признаки Lactobacillus casei: короткие или длинные палочки диаметром менее 1,5 мкм, очень часто имеют уплощенные концы и образуют цепочки, неподвижны. Колонии на плотной среде гладкие, имеют форму чечевицы или алмаза, беловатого или светло-желтого цвета. Рост на бульоне сопровождается помутнением. Обычно ферментирует сорбит; мальтозу и сахарозу часто ферментирует медленнее; гликоген и крахмал не расщепляет. Основной продукт брожения – молочная кислота. Рибозу ферментирует с образованием молочной и уксусной кислот без газа. Для роста нуждается в рибофлавине, фолиевой кислоте, пантотенате кальция и ниацине.
Три подвида L. casei дифференцируют по следующим признакам (табл. 59).
Таблица 59
Подвиды L. casei
От всех других лактобацилл L. casei отличается тем, что до 90 % штаммов всех трех подвидов хорошо растут на среде с пируватом и ферментируют его. Остальные виды лактобацилл этим свойством не обладают. Содержание Г + Ц в ДНК L. casei около 46 мол %. L. casei – постоянный обитатель полости рта, кишечного тракта и слизистой влагалища человека.
Род Actinomyces. К нему относятся грамположительные, неравномерно окрашивающиеся, не образующие спор и неподвижные бактерии. Они не обладают кислотоустойчивостью. Могут образовывать, особенно в 48-часовых микроколониях, нити с истинным ветвлением.
Имеют форму дифтероидных или ветвящихся палочек, нередко в виде V-, Y– или Т-образных форм. Хемоорганотрофы. Сбраживают углеводы с образованием кислоты без газа. Конечные продукты брожения глюкозы – уксусная, муравьиная, молочная и янтарная кислоты, но не пропионовая. Протеолитическая активность наблюдается редко и слабая. Индола не образуют, уреазы не имеют. Факультативные анаэробы. Лучше растут в присутствии СО2. Для роста нуждаются в органическом азоте. Виды дифференцируются по характеру микроколоний (гладкие или нитевидные) и по биохимическим признакам.
Actinomyces viscosus. Отличается от остальных видов тем, что образует каталазу, у остальных видов этот признак отсутствует. Другие отличительные признаки A. viscosus: микроколонии нитевидные; восстанавливает нитраты; не ферментирует арабинозу, рибозу и ксилозу; реакция с метиловым красным положительна; реакция Фогеса – Проскауэра отрицательна; на агаре с тремя сахарами и железом (среда TSI)
образует H2S; гидролизует эскулин, не гидролизует желатин. Различают два серотипа. Выделены из ротовой полости человека, крыс и хомячков. У крыс и хомячков вызывают болезни периодонта, спонтанные и при экспериментальном заражении.
Семейство Spirochaetaceae. В полости рта у человека обнаруживаются следующие виды спирохет: Treponema denticola, T. macrodentium, T. orale и Borrelia buccalis.
Treponema denticola имеет вид тонких спиральных клеток длиной 6,0 – 16,0 мкм и диаметром 0,10 – 0,25 мкм. Концы клеток слегка изогнуты. Две осевые нити (фибриллы) присоединены к каждому концу клетки. Очень немногие осевые нити как бы протянуты между концами клеток. Подвижны. Молодые клетки быстро вращаются вокруг своей оси. Растут хорошо на среде с пептоном, дрожжевым экстрактом и сывороткой в анаэробных условиях. Колонии через две недели культивирования белые, диффузные, размером 0,3 – 1,0 мм. Растут при температуре от 25 до 45 °C. Оптимальная температура 37 °C. Оптимальная для роста рН 7,0; могут расти в диапазоне рН от 6,5 до 8,0. Рост угнетается в присутствии 3 % и более NaCl или 1 % желчи. Для роста обязательно требуется добавление сыворотки животных. Рост стимулирует добавление кокарбоксилазы. Углеводы не ферментирует. Гидролизует крахмал, гликоген, декстрин, эскулин, желатин, но не гиппурат. Большинство штаммов образует индол и H2S. Проба с метиловым красным отрицательная. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 37 – 38 мол %. Обнаруживается в полости рта людей и шимпанзе, обычно в местах соединения зубов с деснами.
Treponema orale – тонкие спиральные клетки длиной 6 – 16 мкм и диаметром 0,10 – 0,25 мкм. Обычно образуют цепочки. Одна осевая нить прикреплена к каждому концу клетки. В бульонной культуре концы клеток часто зернисты. Обладают активной подвижностью. Растут на среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт, а также на среде, применяемой для выращивания микоплазм (PPLO) без кристаллического фиолетового. Каждая из этих сред содержит глюкозу, цистеин, никотинамид, кокарбоксилазу, тетрагидрохлорид спермина, натрий изобутират, а также 10 % инактивированной кроличьей сыворотки или 0,05 % ?2-глобулина. В жидкой среде дает равномерное помутнение. Углеводы не ферментирует, но ферментирует аминокислоты; образует индол и H2S. Гидролизует желатин, но не крахмал. Оптимальная для роста температура 37 °C, рН 7,0. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 37 мол %. Обнаруживается в десневых карманах у людей.
Treponema macrodentium – тонкие спиральные клетки длиной 5 – 16 мкм и диаметром 0,10 – 0,25 мкм. Концы клеток заострены. Одна осевая нить прикреплена к каждому концу клетки. Очень подвижны, молодые клетки обладают быстрым вращательным движением. Растут на среде, содержащей пептон, дрожжевой экстракт, 10 % сыворотки или асцитической жидкости, кокарбоксилазу, глюкозу и цистеин. Для роста обязательно требует добавления животной сыворотки, которая может быть заменена изобутиратом, спермином и никотинамидом. Углеводы ферментирует и использует как источники энергии. Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, фруктозу, мальтозу, ксилозу, сахарозу, галактозу и рибозу. Не ферментирует маннозу, рамнозу, лактозу, арабинозу, маннит, инулин, сорбит и салицин. Крахмал не гидролизует, но гидролизует желатин. Индола не образует, образует сероводород. Оптимальная для роста температура 37 °C, рН 7,0. Содержание Г + Ц в ДНК составляет 39 мол %. Обнаруживается в десневых карманах у людей.
Borrelia buccalis – извитые клетки длиной 7 – 20 мкм и диаметром 0,3 – 0,4 мкм. Это одна из наиболее крупных оральных спирохет, вяло подвижная: обладает извивающейся, сгибательной и слабой вращательной подвижностью. Этот вид боррелий мало изучен, однако он был выделен из полости рта человека.
