Реакция связывания комплемента
Уникальная способность комплемента специфически связываться с различными по своей природе комплексами антиген + антитело нашла широкое применение в реакции связывания комплемента (РСК). Особое преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней (корпускулярный или растворимый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fc-фрагментом любого антитела, относящегося к IgG и IgM, независимо от его антительной специфичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свойства комплемента:
1) способность связываться с комплексом антиген + антитело;
2) лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.
РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы – опытная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реакции прогревают при 56 °C в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена. К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь инкубируют при 37 °C в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образующиеся комплексы антиген + антитело свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса антиген + антитело не произойдет, и комплемент останется свободным. Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяснения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроциты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37 °C в течение 30 – 60 мин, после чего оценивают результаты реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом антитело + + антиген, лизиса эритроцитов не будет – РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов. Если же в сыворотке специфические антитела отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произойдет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе комплемент связывается с комплексом эритроциты + антитела индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и контроль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию. Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20 – 25 % по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10 % раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °C. В основной опыт берут сыворотку, разведенную до 1/3 своего титра.
Непрямая реакция гемолиза используется как ускоренный метод обнаружения специфических антител. В качестве носителя антигенов используют эритроциты. При наличии в сыворотке больного специфических антител сенсибилизированные эритроциты в присутствии комплемента лизируются.
