5.5. Лабораторные методы исследования
Бактериологическое исследование посева аспирата подвздошной кишки, посева промывных вод желудка, посева со среза удаленного лимфоузла брыжейки подвздошной кишки осуществлялось пациентам ОГ. Биологический материал забирался интраоперационно при баугинопластике. Исследование осуществлялось сотрудниками бактериологической лаборатории ГБУЗ НО «Городская клиническая больница № 12 Сормовского района» г. Нижнего Новгорода.
Аспират люменарного и мукозного содержимого подвздошной кишки забирался при баугинопластике. Мы использовали видоизмененную методику интраоперационного определения синдрома избыточного бактериального роста в тонкой кишке, предложенную Перегудовым С. И. (2009) – рационализаторское предложение № 2279 от 26.01.2015 г. «Способ интраоперационной диагностики синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) дистальных отделов тонкой кишки». Интраоперационно в рану выводился участок подвздошной кишки длиной 10 см, расположенный на 20 см проксимальнее илеоцекального угла, который изолировался двумя мягкими кишечными жомами (рис. 14).
Рис. 14. Этап пункции подвздошной кишки: участок подвздошной кишки изолирован кишечными жомами
Производилась пункция просвета изолированного участка подвздошной кишки, игла проводилась косо относительно стенки кишки, в полость кишки вводилось 10 мл стерильного физиологического раствора (рис. 15).
Для максимального насыщения введенного физиологического раствора присутствующей флорой выдерживали экспозицию 5 минут, не извлекая иглу. Затем содержимое изолированного участка подвздошной кишки аспирировали, при этом аспирация продолжалась вплоть до прохождения иглы через слизистый слой кишки, игла извлекалась (рис. 16).
На место пункции накладывали Z – образный серо-серозный шов. Аспират содержимого просвета подвздошной кишки наносился на стерильный тампон и помещался в безкислородную питательную среду Амиеса с углем (Amies Medium with Charcoal in polystyrene tube) в герметичный, светозащищенный контейнер (Hiculture Transport Swarbs, производство Himedia Laboratories Pvt. Ltd) и в дальнейшем направлялся на бактериологическое исследование.
Содержимое отграниченного участка подвздошной кишки разводится 10-ю мл физиологического раствора NaCl, посев осуществляется на стерильный тампон (емкость – 0,1 мл). Таким образом, концентрация содержимого подвздошной кишки разводится в 100 раз, что дает основания увеличивать на 2 порядка полученную в результате бактериологического исследования концентрацию микроорганизмов (КОЕ / мл)
Способ интраоперационного забора содержимого подвздошной кишки позволяет выполнить «золотой стандарт» диагностики СИБР, при этом анализу подвергались оба пула внутрикишечных микроорганизмов, а именно, внутрипросветная и пристеночная флора.
Забор промывных вод желудка производился до начала операции баугинопластики, после вводного наркоза путем аспирации из желудочного зонда. Содержимое желудка вносили на питательную среду в изолированный от окружающей среды контейнер (Hiculture Transport Swarbs, производство Himedia Laboratories Pvt. Ltd) с последующим направлением на бактериологическое исследование.
Рис. 15. Этап пункции подвздошной кишки: в полость кишки введено 10 мл стерильного раствора NaCl 0,9 %
Рис. 16. Этап пункции подвздошной кишки: аспирация и извлечение иглы из просвета подвздошной кишки
При выявлении признаков мезаденита брыжейки подвздошной кишки (рис. 17) во время баугинопластики удаляли один лимфоузел. Дефект брыжейки ушивали. Скальпелем лимфоузел рассекали, со среза обеих частей брали мазок, который затем направляли на бактериологическое исследование.
Бактериологическое исследование кала проводилось пациентам ГК и ОГ до баугинопластики, на 45-сутки после баугинопалстики, в отдаленном послеоперационном периоде. Собранный материал в количестве не менее 3 г помещался в стерильный контейнер и доставлялся в лабораторию не позднее 2 часов с момента сбора пробы. В результате исследования выявлялись признаки мальдигестии (непереваренные нутриенты), мальабсорбции (соли жирных кислот, крахмальные зерна, жирные кислоты) и неспецифические признаки воспаления (лейкоциты, слизь).
Рис. 17. Признаки мезаденита брыжейки подвздошной кишки: множественные увеличенные, плотные лимфатические узлы
Регистрация и анализ результатов бактериологического исследования кала осуществлялись по методике Кучумовой С. Ю. (2014). Согласно протоколу ведения больных с дисбиотическими нарушениями, известны четыре основных типа нарушения состава кишечной микрофлоры (Отраслевой стандарт 91500.11.0004–2003 Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника. – М. 2003.).
1) нарастание количества условно-патогенных микроорганизмов одного или нескольких видов в кишечнике при нормальном количестве бифидобактерий;
2) повышение содержания одного или нескольких видов условно-патогенных микроорганизмов при умеренном снижении концентрации бифидобактерий (на 1–2 порядка);
3) снижение содержания облигатных представителей микробиоценоза (бифидобактерий и / или лактобацилл) без регистрируемого увеличения количества сапрофитной или условнопатогенной микрофлоры кишечника;
4) умеренное или значительное (<107) снижение содержания бифидобактерий, сочетающееся с выраженными изменениями в аэробной микрофлоре – редукцией лактобацилл, появлением измененных форм кишечной палочки, обнаружением одного или нескольких представителей условно-патогенных микроорганизмов в высоких титрах (до 107– 108 КОЕ / г).
Нарушение состава кишечной флоры делилось на 3 степени (Отраслевой стандарт 91500.11.0004–2003 Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника. – М. 2003.):
1 степень: снижение содержания бифидобактерий до 108– 107 КОЕ / г, лактобактерий до 106– 105 КОЕ / г, типичных эшерихий до 106– 105 КОЕ / г, возможно повышение содержания типичных эшерихий до 109– 1010 КОЕ / г;
2 степень: снижение содержания бифидобактерий до 107 и ниже КОЕ / г, лактобактерий до 105 и ниже КОЕ / г, повышение содержания гемолитических эшерихий или других условно патогенных бактерий до концентрации 105– 107 КОЕ / г или обнаружение ассоциаций условно патогенных микроорганизмов в концентрации 104– 105 КОЕ / г;
3 степень: снижение содержания бифидобактерий до 107 и ниже КОЕ / г, лактобактерий до 105 и ниже КОЕ / г, обнаружение ассоциаций условно патогенных микроорганизмов в концентрации 106– 107 КОЕ / г и выше.
Информативность метода бактериологического анализа кала рассчитывалась по нижеприведенным формулам. Определялись такие характеристики, как чувствительность и специфичность указанного диагностического теста. Показатель чувствительности отражает долю положительных результатов у больных людей, а специфичность – долю отрицательных результатов у здоровых лиц.
За «золотой стандарт» принято наличие СИБР, диагностированного на основании результатов бактериологического анализа посева аспирата подвздошной кишки и результатов ВДТ с лактулозой.
Ч – чувствительность;
С – специфичность;
Ип – истинно положительный результат;
Ио – истинно отрицательный результат;
Лп – ложно положительный результат;
Ло – ложно отрицательный результат.
В случае бактериологического исследования кала истинно положительным считался результат обнаружения нарушений состава кишечной микрофлоры при установленном СИБР, ложноположительным – результат, при котором нарушения состава кишечной микрофлоры отмечались у лиц группы контроля, истинно отрицательным – при отсутствии нарушений у пациентов группы контроля, ложно отрицательным – при отсутствии нарушений у пациентов основной группы.
Кальпротектин фекалий определялся у пациентов ГК и ОГ до и после операции на 45-е сутки. Кальпротектин – это гетерокомплекс Са2+ – зависимых белков, экспрессируемых нейтрофилами и макрофагами. Выделяется при активации или гибели этих клеток и вовлекается в регулирование воспалительного процесса. Таким образом, кальпротектин является диагностическим критерием альтеративного воспаления в кишечнике, поддерживаемого ИЛ10-сигнальным каскадом. Прогностическая ценность положительного результата для патологических находок при эндоскопическом исследовании 80 %, отрицательного результата – 75 %. Для пациентов исследуемых групп чувствительность и специфичность методики определения кальпроктектина составили 89 % и 79 % соответственно для воспалительных заболеваний кишечника, и 85 % и 71 % при СРК. Кальпротектин фекалий отличается устойчивость в кале и является показателем активности и распространенности интестинального воспаления.
Качественная реакция мочи на индикан выполнялась по методике Обермейера и проводилась пациентам ГК и ОГ до операции и на 7-е сутки после операции. Принцип пробы основан на превращении индикана в индоксил минеральной кислотой и последующее окисление индоксила хлорным железом в синее индиго. Синее окрашивание указывает на присутствие индикана в моче более нормы. В моче здорового человека индикан содержится в незначительном количестве (до 100 мкг / мл), которое не обнаруживается обычными качественными пробами. Индиканурия встречается при интенсивном гниении триптофана протеолитической флорой в кишечнике, а также при усиленном распаде белков в организме (эмпиемы, абсцессы и др.). Таким образом, индиканурия является косвенным методом определения синдрома избыточного бактериального роста.
Определение молекул средней массы (МСМ) по методике Н. И. Габриэляна проводилось у пациентов ГК и ОГ до и после операции. Принцип метода заключается в осаждении крупномолекулярных белков сыворотки крови раствором 10 % трихлоруксусной кислоты, которая изменяет третичную и четвертичную структуру белка, в результате чего он денатурирует и выпадает в осадок. В надосадочной жидкости остаются вещества низкой и средней молекулярной массы, которые исследовали при длине волны в 254 нм. Для исследования сыворотки крови использовали центрифугу и спектрофотометр. Ход определения: к 1 мл сыворотки крови добавляли по каплям 0,5 мл 10 % трихлоруксусной кислоты, перемешивали и центрифугировали при 3000 оборотах в минуту в течение 30 минут. Надосадочную жидкость разводили в 10 раз дистиллированной водой и оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при 254 нм в сравнении с водой. Результат отмечали в единицах оптической плотности. Норма – 0,24±0,02 у. ед.
Гистологическому исследованию подверглись операционный материал, взятый при баугинопластике, и биоптаты различных отделов тонкой и толстой кишок, взятые при колоноскопии и интестиноскопии у пациентов до операции. Операционный материал – удаленный червеобразный отросток (при баугинопластике с аппендэктомией) и удаленный лимфоузел брыжейки подвздошной кишки при мезадените. Определение морфологической картины исследуемых образцов тканей позволило выявить критерии исключения пациентов из ГК и ОГ (ХВЗК, мета– неоплазии различной степени дифференцировки и т. д.) и неспецифические воспалительные изменения в слизистой оболочке кишки и лимфоузле.
